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日本结缕草ZjNAC2转录激活验证及互作蛋白的初步筛选

2019-07-25姜红岩檀鹏辉尹淑霞武菊英

草地学报 2019年3期
关键词:文库酵母菌落

姜红岩, 檀鹏辉, 滕 珂, 尹淑霞*, 武菊英*

(1. 北京林业大学草业与草原学院, 北京 100083; 2. 北京草业与环境研究发展中心, 北京 100097)

转录因子能够与基因启动子的顺式作用元件结合来调节基因的表达,从而调控生命活动中的各种信号传导途径[1]。NAC(NAM(No apical meristem),ATAF(Arabidopsis transcription activation factor)1/2,CUC2(Cup-shaped cytoledon))是植物中所特有的转录因子,在调节植物的生长发育、胁迫响应、次生生长调控及激素信号转导等过程中发挥着重要作用[2-4]。近年来,越来越多的研究不仅仅局限于转录因子本身,对转录因子上下游的调控机制的研究也越来越多。

酵母双杂交是鉴定两个蛋白相互结合的最直接和最广泛的分子生物技术[5]。酵母双杂交系统基于酵母中的一个Gal4转录因子,该转录因子上有两个不同的结构域,一个是转录激活结构域(Activation Domain,AD),一个是DNA结合结构域(DNA-binding Domain,BD)[1,6],这两个结构域是互相独立的,只有当这两个结构域在空间上足够接近时,才会激活Gal4的转录活性,从而调控下游报告基因的表达[1,6-8]。若将已知的编码AD分别与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接,获得‘猎物’载体;BD连接目的基因,获得‘诱饵’载体,共转化酵母细胞[9-10]。当酵母细胞中表达的诱饵蛋白与猎物载体表达的某个蛋白质发生互作,AD与BD就会靠近,报告基因就会表达[10]。通过这一系统,可为在cDNA文库中筛选与目的蛋白结合的上下游蛋白提供可能。目前cDNA文库的构建主要通过SMART、Cap-trapper等技术,通过将某一物种的基因组中的所有基因断裂并转入单独的质粒中,为目的蛋白筛选互作蛋白提供基础。

日本结缕草(Zoysiajaponica)是一种抗逆性强的暖季型草坪草,广泛应用于各种运动场草坪、园林绿化、家庭庭院等草坪中[13-15]。草坪草的生存环境复杂多变,经常遭受干旱、高盐、低温和病虫害等逆境胁迫[16-17]。这些逆境胁迫会影响植物的生长发育,甚至造成草坪草死亡,严重影响景观[16-17]。近年来越来越多的研究表明NAC转录因子对逆境胁迫的响应过程中的调节具有重要作用[2,18]。盐芥(Thellungiellasalsuginea)中的TsNAC1过表达可以提高非生物胁迫抗性,尤其是盐胁迫抗性;TsNAC1能够结合并且正调节与离子转运相关的基因TsVP1、MYBH、HB12,能够抑制LSH1、TXT2,并且能够直接调控MSI4基因的表达[4]。前期的研究表明ZjNAC2能够响应非生物胁迫。干旱处理后ZjNAC2的表达下调,而盐处理后ZjNAC2的表达上调,但目前对ZjNAC2转录因子在日本结缕草中胁迫抗性的作用机理及上下游的调控网络并不清楚。本研究旨在通过前期构建的高质量的日本结缕草的均一化cDNA文库,利用酵母双杂技术筛选与ZjNAC2转录因子互作的蛋白,以期为进一步了解日本结缕草抗胁迫调控网络提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验中所用的日本结缕草品种为‘Meyer’,由江苏省中科院植物研究所刘建秀研究员会惠赠。RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自OMEGA公司(美国);反转录试剂盒、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、pMD19-T载体、SYBR Mix购自TaKaRa公司(大连,中国);大肠杆菌感受态DH5α购自北京全式金生物技术有限公司(北京,中国)。X-α-Gal(TaKaPa)、YPDA酵母培养基及缺陷型培养基购自泛基诺公司(北京,中国)。pGBKT7酵母载体、Y2HGold酵母菌株均为本实验室(北京林业大学草坪研究所)所保存。

1.2方法

1.2.1 诱饵载体pGBKT7-ZjNAC2及cDNA文库的构建 以健康生长的日本结缕草为材料,提取总RNA,反转录为cDNA。以ZjNAC2-F/ZjNAC2-R为引物进行PCR扩增,PCR产物经凝胶电泳检测正确后与pMD19-T载体连接,转化大肠杆菌感受态DH5α,阳性克隆菌液送睿博兴科生物技术有限公司(北京)测序,获得ZjNAC2正确的基因序列。以pMD19-ZjNAC2的质粒为模板,以BD-ZjNAC2-F/BD-ZjNAC2-R为引物进行PCR扩增,PCR产物经凝胶电泳检测正确后与pGBKT7酵母载体连接,转化大肠杆菌感受态DH5α,阳性菌液送睿博兴科生物技术有限公司(北京)测序,测序正确的菌液保存并提取质粒用于后续实验。以不同程度黄化的日本结缕草叶片为材料,通过TaKaRa生物公司(大连)构建高质量的日本结缕草的均一化cDNA文库。

1.2.2 ZjNAC2转录自激活验证 通过LiAc[19]的方法制备Y2HGold酵母感受态,将上述构建好的诱饵载体pGBKT7-ZjNAC2及对照质粒pGBKT7转入酵母感受态中,涂布在SD/-Trp培养基上,30℃下培养。待长出菌落后,挑取单克隆菌落于YPDA液体培养基中培养,之后将酵母菌液分别按比例1:10、1:100进行稀释并点于SD/-Trp、SD/-Trp-His-Ade固体培养基上,30℃下培养2~3天,观察其生长情况。

1.2.3 酵母双杂交文库的筛选 将诱饵载体pGBKT7-ZjNAC2+pGADT7-cDNA文库及阳性对照pGBKT7-53+pGADT7-T、阴性对照pGBKT7-lam+pGADT7-T分别共转化Y2HGold酵母感受态细胞中,涂布于SD/-Trp-Leu固体培养基上,30℃下培养2~3天。阳性对照pGBKT7-53+pGADT7-T和阴性对照pGBKT7-lam+pGADT7-T分别转化酵母感受态细胞,涂布于SD/-Leu-Trp固体培养基上。挑取单克隆菌落在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal或SD/-Leu-Trp-His-Ade固体培养基中划线培养2~3天。挑取阳性克隆的菌落于YPDA中培养,以AD-R/T7-F为引物对阳性菌落进行PCR检测,反应程序为95℃10 min;95℃30 s,55℃30 s,72℃60 s,40个循环;72℃5 min,12℃保温。经凝胶电泳鉴定后有条带的PCR产物送睿博兴科生物技术有限公司(北京)测序,确定候选基因。

表1 引物列表Table 1 Primers list

1.2.4 候选基因的生物信息学分析 通过百迈客的云平台小工具(https://console.biocloud.net)进行NR、GO、KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)等注释,获得候选基因的生物信息学信息。

2 结果与分析

2.1 诱饵载体pGBKT7-ZjNAC2的构建

以与pMD19-T载体连接的ZjNAC2质粒为模板进行PCR扩增,PCR产物经凝胶电泳检测后得到1条约1100bp左右的条带(图1)。通过菌落PCR,将条带大小正确的菌液送睿博兴科生物技术有限公司(北京)测序,测序结果经过序列比对后正确,表明pGBKT7-ZjNAC2载体成功构建。

图1 pGBKT7-ZjNAC2载体构建Fig.1 Construction of the pGBKT7-ZjNAC2 vector

2.2 ZjNAC2转录自激活验证

分别将pGBKT7、pGBKT7-ZjNAC2载体转入酵母感受态中,涂布在SD/-Trp培养基上。30℃下培养3天后,pGBKT7、pGBKT7-ZjNAC2在SD/-Trp培养基上均能正常生长(图2),表明pGBKT7、pGBKT7-ZjNAC 2对酵母菌株Y2HGold无毒性作用。挑取在SD/-Trp培养基上生长的菌落,分别稀释10、100倍点于SD/-Trp、SD/-Trp-His-Ade固体培养基上。2~3天后,SD/-Trp培养基上菌落正常生长;而SD/-Trp-His-Ade上无菌落生长(图3)。试验结果表明,ZjNAC2没有转录自激活活性,可以进行酵母双杂交的筛选。

2.3 酵母双杂筛选候选基因

以pGBKT7-53+pGADT7-T为阳性对照,pGBKT7-lam+pGADT7-T为阴性对照与pGBKT7-ZjNAC2+pGADT7-cDNA分别转入酵母感受态细胞中,涂布在SD/-Trp-Leu缺陷型固体培养基上。结果表明,对照组与试验组均能在SD/-Trp-Leu缺陷型培养基上生长(图4),表明质粒共转化成功。将阳性对照和阴性对照分别涂布在SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基上,阳性对照的菌落能够正常生长,而阴性对照不能在SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基上生长。挑取在SD/-Trp-Leu缺陷型培养基上生长的菌落在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal缺陷型培养基上划线。结果表明,大部分菌落均能在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal缺陷型培养基上生长并且变蓝(图4)。挑取30个变蓝的菌落进行菌落PCR鉴定,凝胶电泳结果显示有25个菌落可以扩增出条带(图5)。试验选取了20个有条带的PCR产物送到睿博兴科生物技术有限公司(北京)测序。

图2 酵母毒性检测Fig.2 Yeast toxicity test

图3 ZjNAC2转录自激活验证Fig.3 Transcriptional self-activation validation ofZjNAC2注:SD:合成的营养缺陷型培养基Note:SD:synthetic dropout nutrient medium

图4 ZjNAC2酵母双杂筛库Fig.4 Yeast two-hybrid library screening

图5 候选克隆PCR检测Fig.5 Candidate clone PCR detection

2.4 候选基因的生物信息学分析

通过百迈客云平台的基因功能注释功能,对测序得到的20个基因序列进行了NR注释、GO注释、KEGG注释。NR注释分析结果显示,20个注释基因NR同源物种比对到9个物种,其中比对到高粱(Sorghumbicolor)中的注释基因最多,6个;其次是玉米(Zeamays)5个,粟(Setariaitalica)4个(表2)。GO注释结果显示ZjNAC2的这20个候选互作蛋白参与的生物进程有9种,包括代谢过程、生物调节、免疫系统过程等(图6)。KEGG注释结果显示候选蛋白富集到了半乳糖代谢、自噬调节、糖酵解、戊糖磷酸途径、嘧啶代谢等代谢通路中。

表2 ZjNAC2互作蛋白及同源物种Table 2 ZjNAC2 interaction proteins and homologous species

3 讨论

NAC基因在植物发育和胁迫的不同方面发挥重要作用,包括胚胎发育、次生壁形成、叶片衰老、侧根发育、病毒真菌感染、机械损伤及胁迫响应等[3]。云杉[20](Piceawilsonii)中的PwNAC2转录因子增强了植物对非生物胁迫的耐受性,通过酵母双杂筛选到PwNAC2与RFCP1发生互作,荧光素酶互补和双分子荧光互补试验均证实了两者的相互作用,并且PwRFCP1参与了开花调控。通过酵母双杂交技术发现,大豆中的GmWRKY27与GmMYB174发生互作,GmMYB174直接抑制GmNAC29基因表达,并且减少活性氧产生和脯氨酸降解,使大豆的抗性增强[21]。本研究通过该技术对日本结缕草中的ZjNAC2转录因子筛选互作蛋白,结果显示该试验获得了50个左右的阳性菌落,为进一步深入研究ZjNAC2的功能提供了基础。

试验挑选了30个阳性菌落进行PCR检测,检测结果显示有25个菌落扩增出了条带,表明存在假阳性菌落。并且有多个菌落扩增出了多个条带,产生多个条带的结果很可能是共转化时转入了多个质粒。通过对20个送测序的互作蛋白进行生物信息学分析,NR注释分析显示20个注释基因中比对到高粱(Sorghumbicolor)中的注释基因最多。在ZjNAC2筛选的互作蛋白中,筛选到一个与抗病相关的蛋白EDR1-Like。研究表明,拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的EDR1、EDR2、EDR3基因是调控植物抗病的关键基因,基因的突变会导致植物对白粉病菌抗性提高[22-23]。小麦(Triticumaestivum)中的TaEDR1基因类似于拟南芥中的EDR1基因,其表达受白粉病菌的诱导而增强[24-25]。同时还筛选到了SDF2、NFY-A3、40S核糖体、SIP1等蛋白,其中NF-Y是一类普遍存在于高等真核生物中的转录因子,在胚胎和种子发育、胁迫响应、脱落酸信号传导、叶绿素合成、氮固定、植物生长发育等进程中发挥重要作用[26-27];40S核糖体是构成核糖体的重要组成部分,对核糖体转录效率和稳定性具有重要影响[28];SIP1基因最早从烟草中被鉴定出,与细胞的生长和增殖及叶片的生长发育有关[29]。通过酵母双杂试验筛选到了与ZjNAC2互作的蛋白,通过对其进行生物信息学分析,为进一步研究提供了重要参考。

图6 ZjNAC2候选互作蛋白的Gene ontology注释Fig.6 Gene ontology annotation of the ZjNAC2 candidate interaction protein

酵母双杂筛库技术是确定两个蛋白互作的关键技术之一,具有高灵敏性和完善的报告系统[30-31]。但酵母双杂筛选只能捕获直接配对的相互作用,包括弱相互作用[1]。蛋白质的表面可能存在一些低亲和力区域,其他蛋白会在这些区域与目的蛋白作用形成结构稳定的复合物,这些情况都可能引起报告基因的表达,因此存在假阳性的情况[5,32]。所以在后续研究中还要通过免疫共沉淀或双分子荧光互补等试验进一步验证这些蛋白与ZjNAC2互作的真实性,并对筛选到的蛋白逐一验证并通过相互作用的蛋白研究ZjNAC2的调控机制及生物学通路。

4 结论

本试验成功构建了诱饵载体pGBKT7-ZjNAC2,转录自激活活性检测表明ZjNAC2没有转录自激活活性,可以进行酵母双杂交文库的筛选。酵母双杂筛库的试验中随机挑取了30个阳性菌落,筛选到20个与ZjNAC2互作的蛋白并对其进行了NR注释、GO注释及KEGG注释。初步筛选到4个与抗病、植物生长发育过程相关的候选互作蛋白,为进一步探究ZjNAC2在日本结缕草中的作用机制奠定了基础。

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