AMF与坪床基质对“兰引3号”结缕草草坪磷元素有效性及其流失的影响

彭 雪， 程俊康， 辛国荣

(广东省热带亚热带植物资源重点实验室， 中山大学生命科学学院, 广东 广州 510275)

2016年5月国家发改委在《全国足球场地设施建设规划(2016-2020年)》[1]中明确提出了建设目标：到2020年，全国足球场地数量超过7万块，按照标准足球场长105 m、宽68 m来计算，到2020年，国内足球场面积将达到5 000万m2，这将给足球场草坪的发展带来无限的机遇和技术上的挑战。标准的足球运动场草坪坪床基质结构特殊，且以砂基坪床为主，砂基坪床因其良好的透水透气性被用于建造运动场坪床，但是砂基坪床的保水保肥性较纯土坪床相对较差，坪床中养分容易流失，特别是南方地区高温多雨，引起养分流失和地下水污染的风险更高。因此，如何做到球场草坪质量优良，节约资源，进而防止环境污染，是草坪科技和管理者需要解决的问题。

草坪草种的选择是建植高级草坪的首要因素，根据区域和地理环境的不同，选择适合条件的草坪草种，以满足足球场草坪的坪用性状要求。“兰引3号”结缕草(Zoysiajaponica‘Lanyin No. 3’)作为典型的暖季型草坪草，具有建坪速度快，耐践踏，叶质良好，不易擦伤皮肤等优点，被广泛用于我国南方运动场建植中，如广州天河体育场、广东奥林匹克体育中心、广州大学城中心体育场等。

近年来从基质改良着手，利用一些有益微生物的共生特点，辅助完成高级运动场草坪管理的微生物技术引起人们的关注。丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)就是其中的一类，它能与陆地80%以上的被子植物形成共生结构。AMF与植物根共生后，其根外菌丝形成庞大的“菌丝网络”，扩大植物根部养分吸收范围，植物通过菌丝将根系吸收不到的养分吸收利用，AMF不仅能活化土壤中的矿质养分，促进植物对营养元素如氮、磷[2-3]等矿质元素的吸收和利用效率，而且植物根际与AMF菌丝之间的“元素贸易”与土壤中N、P元素的比率密切相关；同时，外延菌丝还可通过侵入点再度侵染邻株植物根系后，在多株相同或不同植物之间形成庞大的地下公共菌丝网(Common mycorrhizal networks,CMN)，CMN的形成能够加强邻株植物之间营养元素的传递，对植物个体间营养平衡和物种多样性维持等方面具有重要的生态功能。鉴于菌根在植物营养吸收中的独特作用，本研究选择被广泛用于南方足球运动场草坪建植的“兰引3号”结缕草，通过设计基质配比和菌根真菌接种试验，对比分析AM对养分(磷元素)的吸收、吸附、流失的影响，进一步探讨AMF侵染在足球场草坪水肥管理建植中的作用效应及应用前景。

1 材料与方法

1.1 坪床基质准备

通过模拟足球运动场草坪坪床根际混合层(约10 cm)进行试验。选用营养土与河砂作为坪床基质，营养土(满园春营养土)主要成分包括活性炭、珍珠岩、蛭石、腐熟植物秸秆、酒渣、鸡粪；河砂为建筑用砂。有研究表明，当含砂量为50% ～ 75%(体积比)时，保水保肥性最好，且具有较好的土壤通气状况[4]。因此，本试验设置土砂体积比例分别为2∶8(含砂量为80%)、4∶6(含砂量为60%)、6∶4(含砂量为40%)。营养土以及洗净的河砂于高温高压灭菌锅中灭菌120℃，2次，每次30 min。放置至室温后，按照上述体积比将河砂与营养土混匀，分别装于100 mm×85 mm×95 mm(口底高)的塑料花盆中。对种植前基质的重量以及基质中碱解氮、全氮、速效磷、全磷、全钾含量进行测定(表1)。花盆事先经过70%酒精浸泡30 min后，用自来水冲洗数次直至干净。

表1 设计坪床基质基础养分状况Table 1 Nutrient condition of potting media before planting

1.2 菌剂的施用

摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)、根内球囊霉(Rhizophagusintraradices)由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供。菌剂采用湿筛倾析法检测5 g菌剂的孢子数量，发现摩西管柄囊霉与根内球囊霉的孢子数量分别是97个和23个。摩西管柄囊霉组每盆加入2.5 g菌剂，根内球囊霉组每盆加入10 g菌剂，以保持较为一致的接种势。在距花盆口2 cm处加入菌剂或不加。

1.3 试验处理

试验设不接种对照组(ck)，接种摩西管柄囊霉组(Funneliformismosseae,Gm)、接种根内球囊霉组(Rhizophagusintraradices,Ri)三个处理；基质配比营养土:河砂体积比分别是2∶8，4∶6，6∶4。每个处理重复4次，共36盆。

1.4 植株种植培养与采集

草坪草为“兰引3号”结缕草(Zoysiajaponicacv. lanyin No. 3)，草种购买于小胖花园园艺网店，草种发芽率为80%。2015年7月17日播种，播种量为每盆1 g，表面覆一层约1 mm的基质，淋水保持湿度，放入恒温培养箱培养，出芽后于当月31日将盆移入大棚进行管理养护。用自动喷灌系统每天早晚各喷灌1 min。10月28日(已成坪)，每盆加入德国狮马牌复合肥m(N)∶m(P)∶m(K)=15∶15∶15(厦门四叶草肥料超市)0.4 g。复合肥实际m(N)∶m(P)∶m(K)=6.9∶4.3∶11.7(中科检测有限公司测定)。施肥后用喷壶连续淋水3 d，每天3次，确保基质湿润且无渗滤液流出。11月1日进行渗滤液收集。

1.5 渗滤液及样品收集

在每个花盆下方放置渗滤液接收装置，分别对不接种对照组(ck)，接种摩西管柄囊霉组(Gm)、接种根内球囊霉组(Ri)的渗滤液进行收集测定。11月1日进行第一次大量浇水，每盆体积相同，浇水后等待30 min，直至盆底有极少或没有液滴流下，收集渗滤液并用量筒测定体积，取10 mL用滤膜进行过滤，除去渗滤液中的土壤颗粒及杂质，过滤后的渗滤液保存于10 mL离心管中，用于正磷酸根离子测定；于11月5日和11月9日重复11月1日的操作。11月10日分别收集植物地下部与地下部。将植物地上部剪下，洗净后放于纸袋中于70℃烘箱中烘干用于植物地上部P含量的测定；植物地下部抖落根际多余泥土，洗净，称鲜重，部分放于4℃冰箱进行保鲜，用于侵染率等指标的测定，剩余地下部样品放于纸袋中于70℃烘箱中烘干用于P含量的测定。

1.6 理化指标及微生物指标测定

植物中磷含量采用钼锑抗比色法[5]。基质有效磷：0.05 mol·L-1HCL-0.025 mol·L-1H2SO4浸提，钼锑抗比色法[6]。渗滤液中的离子用离子色谱仪(阴离子检测Thermo Dionex ICS-5000，阳离子检测Thermo Dionex ICS-900)测定正磷酸根离子含量[7]。

植物根系AMF侵染率(菌丝侵染率、丛枝侵染率、泡囊侵染率、总侵染率)采用台盼蓝(trypanblue)染色镜检法[8]，镜检计数时采用网格计数法[9]。基质中孢子数量采用湿筛倾析法[10]进行分离后在体视镜下进行镜检计数。

1.7 数据分析

试验数据均以平均值±标准误表示；结果用SPSS 2.0软件进行双因素方差分析(two-way analysis of variance)，主效应显著则用LSD法进行事后检验分析，交互作用显著则进行简单效应分析，对无显著交互效应的指标用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析相同基质下ck组，Gm组，Ri组之间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 AMF侵染情况

从表2看出，在3种试验坪床基质下，接种Gm或Ri，“兰引3号”结缕草根内主要的侵染形式为菌丝侵染，泡囊侵染较少，丛枝侵染罕有或少有(忽略不计)。接种Gm在2∶8，4∶6，6∶4的土砂比基质中菌丝侵染率分别达到了16%，26%，15%，其中4∶6土砂比基质中Gm菌丝侵染率最高；而接种Ri在2∶8，4∶6，6∶4土砂比基质中菌丝侵染率分别达到了18%，11%，14%，其中2∶8土砂比基质中Ri的菌丝侵染率最高。

另外，2∶8土砂比基质中，Gm、Ri与ck之间在菌丝侵染率和总侵染率指标中出现了极显著差异，而接种Gm与Ri之间的菌丝侵染率与总侵染率均未达显著差异(表2)；4∶6土砂比基质中，4∶6Gm组的菌丝侵染率与总侵染率显著高于4∶6ck组与4∶6Ri组，且4∶6Ri也显著高于4∶6ck(表2)；6∶4土砂比基质中，接种组与6∶4ck之间在菌丝侵染率与总侵染率指标上差异显著(6∶4ck-6∶4Gm：P菌丝<0.01，P总<0.01；6∶4ck-6∶4Ri：P菌丝<0.01，P总<0.01)，而6∶4Gm与6∶4Ri间差异不显著(表2)。

对总侵染率进行双因素方差分析结果表明，土壤基质与菌剂的交互效应对总侵染率没有显著影响，且土壤基质主效应对于总侵染率也没有显著影响，但菌剂主效应显著影响总侵染率(P<0.01)。

表2 不同处理AMF侵染率Table 2 AMF colonization rate in different treatments

注：表中结果表示为平均值±标准误。其中各处理样品数为3。不同小写字母表示同一基质下不同接种处理各侵染形式间具有差异显著性(P<0.05)

Note：The results in the table were expressed as mean± standard error. The number of repeat samples was 3. Different lowercase letters indicated significant difference among colonization rate under the same soil matrix at the 0.05 level

2.2 AMF与基质对结缕草生物量的影响

相同基质下，6∶4Gm组与6∶4Ri组地上部生物量显著低于6∶4ck组，而在2∶8和4∶6基质中接种组与ck组之间差异不显著，即接种Gm与Ri在6∶4基质下能够显著的减少“兰引3号”结缕草地上部干重。而对植物地下部鲜重而言，相同基质下，不论接种Gm或Ri，其地下部生物量均与ck组之间无显著差异(图1)。

图1 三种基质下接种菌剂与不接种菌剂对结缕草生物量的影响Fig.1 The effect of potting media and AMF on grass biomass注：图中结果表示为平均值，误差线代表标准误。其中地上部各处理样品数为4，地下部各处理样品数为3。不同的小写字母代表相同基质下不同处理间具有显著性差异(P<0.05)Note：the results in the figure are expressed as the mean value,and the error line represents the standard error. N=4 for each treated sample of aboveground index,and n=3 for each treated sample of underground index. Different lowercase letters represent significant differences between different treatments under the same soil matrix at the 0.05 level

2.3 AMF与基质对P元素的影响

对基质中有效磷总量、结缕草地上部与地下部磷总量、以及渗滤液中正磷酸盐总量(表3)进行双因素方差分析发现，基质与AMF的交互作用显著，主要体现在基质有效磷总量、结缕草地上部磷总量以及渗滤液中正磷酸盐总量方面(表4)。2∶8ck的基质速效磷总量显著低于2∶8Gm(P< 0.05)与2∶8Ri(P< 0.05)，但6∶4Ri组速效磷总量极显著低于6∶4ck组(P< 0.01)；在4∶6基质中，不接种组(ck组)与接种Gm或Ri组之间在基质速效磷总量上差异未达显著。从基质中有效磷占试验体系中输入总磷量(种植前相同基质配比下的全磷总量+施肥加入的磷元素的量)的比例来看，2∶8Gm(49.77%)与2∶8Ri(51.28%)显著高于2∶8ck(29.17%)。

植物地上部P总量，6∶4ck组显著高于6∶4Gm组(P< 0.01)和6∶4Ri组(P< 0.01)，但在2∶8或4∶6基质中，ck组、Gm组、Ri组之间差异未达显著。分析植物地上部P占试验体系中输入总磷量比例，6∶4Gm和6∶4Ri显著低于6∶4ck组，而在2∶8与4∶6配比中，接种与否不影响地上部P元素的占比。结合双因素方差分析结果，值得注意的是，4∶6基质地上部磷总量占比显著高于2∶8基质占比，也就是说，在2∶8与4∶6基质中接种AMF对结缕草地上部P总量没有显著影响，基质的不同更能影响植物地上部P元素的总量，且4∶6基质相较于2∶8基质能够积累更多的地上部P元素。

而地下部的P，在相同的基质中，接种与不接种之间差异不显著。双因素方差分析发现，基质与菌剂因素对植物地下部P元素总量影响显著，但是基质与菌剂之间不存在交互作用。相同的基质下，接种AMF与否对植物地下部P元素影响不大。

单因素方差分析发现，2∶8ck组渗滤液中磷酸根离子总量显著低于2∶8Gm组(P< 0.01)与2∶8Ri组(P< 0.01)，而同样的趋势出现在4∶6基质中，4∶6ck组磷酸根离子显著低于4∶6Gm组(P< 0.01)和2∶8Ri组(P< 0.05)。双因素分析可知，菌剂与基质能够显著的影响渗滤液中正磷酸根离子总量，且菌剂与基质之间存在着极显著的交互效应(P< 0.01)。而且通过分析渗滤液中正磷酸根离子总量占体系输入磷总量比例数据可以得知，三种基质截留P元素的能力分别是：6∶4基质强于4∶6基质强于2∶8基质，而且在2∶8和4∶6基质中，接种AMF能够显著的减少P酸根离子的流失。

表3 AMF与基质对坪床基质、植物、渗滤液中P元素总量影响Table 3 Effect of potting media and AMF on P transport in potting media,plant and leachate

注：表格中数值表示平均值±标准误。地上部指标各处理样品数n=4，地下部指标各处理样品数n=3。不同的小写字母代表相同基质下不同菌剂处理间差异显著(P<0.05)。占比为占试验体系输入的磷元素的总量，即种植前相同基质配比下的全磷总量+施肥加入的磷元素的量。基质有效磷占比(%)=基质有效磷总量/(种植前相同基质配比下的全磷总量+施肥加入的磷元素的量)╳100%;地上部磷占比(%)=地上部磷总量/(种植前相同基质配比下的全磷总量+施肥加入的磷元素的量)╳100%;地下部磷占比(%)=地下部磷总量/(种植前相同基质配比下的全磷总量+施肥加入的磷元素的量)╳100%;渗滤液中磷酸根离子占比(%)=渗滤液中磷酸根离子总量/(种植前相同基质配比下的全磷总量+施肥加入的磷元素的量)╳10

Note:The values in the table represent the mean standard± error. N=4 for each treated sample of aboveground index,and n=3 for each treated sample of underground index. Different lowercase letters represent significant differences between different AMF under the same substrate at the 0.05 level. The proportion is the total amount of phosphorus input into the test system,that is,the total amount of total phosphorus under the same soil matrix before planting + the amount of phosphorus added by fertilization. Effective phosphorus proportion in the soil (%)=total effective phosphorus in the soil / (total phosphorus before planting in the soil under the same soil matrix + phosphorus in fertilizer application) ╳ 100%;Aboveground phosphorus ratio (%)=total phosphorus of aboveground / (total phosphorus before planting in the soil under the same soil matrix + phosphorus in fertilizer application) ╳ 100%;Underground part of phosphorus ratio (%)=total phosphorus of underground / (total phosphorus before planting in the soil under the same soil matrix + phosphorus in fertilizer application) ╳ 100%;Phosphate ions proportion in leachate(%)=total phosphate ion in leachate / (total phosphorus before planting in the soil under the same soil matrix + phosphorus in fertilizer application) ╳ 10

表4 P元素的总量变化双因素方差分析Table 4 Two-way ANOVA analysis of P transport

注：黑色加粗字体为具有显著相关性(P<0.05)或为极显著相关(P<0.01)

Note：Bold black fonts were significantly correlated at the 0.05 level or very significantly correlated at the 0.01 level

3 讨论与结论

由于大气中P沉降到土地中的量非常低(<0.1 kg·ha-1·yr-1)，所以在陆地生态系统中土壤就成为植物以及土壤微生物主要的磷元素来源[11-12]。在本研究中，土壤基质以及外施化肥的P成为整个试验体系中P元素的主要来源。

不同的土壤基质会影响土壤中磷的保持和流失，砂质土壤的淋溶是粘性土壤的10倍以上[13]。有研究表明，砂壤在淋洗前后基质表层(0～10 cm)中的有效磷从39.4 mg·kg-1降低到33.5 mg·kg-1，降幅为5.9 mg·kg-1；壤质土则从41.3 mg·kg-1降低到38.6 mg·kg-1，降幅仅为2.7 mg·kg-1；说明砂质土中速效养分吸持能力较弱[14]。本研究中试验后2∶8ck、4∶6ck、6∶4ck基质中的有效磷总量相较于试验前分别减少了29%，13%，20%。也反映出基质中砂含量越大，P元素越易流失。

有趣的是接种AMF能够显著的增加基质中有效磷的总量，2∶8Gm和2∶8Ri组有效磷总量相较接种前分别增加了约22%，25%，并且有效减少了基质中有效磷总量的流失，从一定程度上来看，AMF可以影响土壤和宿主植物中P元素总量和效率，AMF对P元素的影响至关重要。有研究表明，在磷转运方面，AMF外生菌丝可以将无机磷转化为多聚磷酸盐，以多聚磷酸盐的形式运输到内生菌丝中，内生菌丝中的多聚磷酸盐通过水解释放无机磷到菌根细胞中，进而传递给宿主植物[15]；接种AMF的白三叶对根际土壤有效磷利用率相较于不接种组提高了48%[16]；对多花黑麦草与红三叶分别接种Claroideoglomusclaroideum，Rhizoglomusirregulare和Funneliformismosseae，发现接种AMF能够显著增加红三叶磷总量、总生物量以及多花黑麦草磷总量[17]。而且接种AMF可以增加宿主植物生物量[18-20]。这些研究结果不同程度上支持了我们的结论，土壤基质以及AMF侵染影响了试验体系中P元素的流失和吸收，以及草坪草的生长；而且土壤基质和AMF之间的交互作用会共同影响基质中的有效磷、植物地上部磷、渗滤液中的磷酸根离子的总量。

但是，我们也发现AMF的作用并不具有普适性[21]。本试验中在4∶6基质和6∶4基质中接种AMF，不但没有增加基质中的有效磷总量以及植物地上部和地下部的磷，反而在6∶4基质中出现了下降的趋势，6∶4Ri组有效磷总量相较于种植前基质中有效磷总量减少了37%。可能是由于一方面AMF受到了基质总体养分的影响，6∶4基质养分含量较高(见表1)，AMF接种效应不明显所致。Yano等人[22]研究发现，在酸性土壤中(pH 4.2，粉壤土，9.4% 有机质)种植甘薯并接种Glomusmargarita后并不能改善其对P元素的吸收。suri等人[23]在酸性淋溶土基质(含砂20%，粉土45%，粘土34%)上种植小麦，并接种无梗囊霉属与根内球囊霉属AMF，也发现小麦对P元素的吸收并没有显著的改善。另一方面，AMF可能受到基质中P元素含量的影响，当土壤中P含量过高时，AMF活性降低，P吸收和转运功能受到影响，从而影响土壤微生物的活性和丰度[24]，6∶4基质中P总量高于其它两种基质，可能基质P总量过高，反而抑制了微生物的侵染率以及活性。另外，种植小麦并分别施入P25(25 kg·ha-1)，P100(100 kg·ha-1)的磷肥，在小麦生长的kernel dough阶段测定根际AMF的侵染率，发现对照组与P25的总侵染率分别为43.56%，53.56%，而且二者显著高于P100(23.95%)[25]。还有研究发现接种AMF的生菜在具有相对较高土壤碱解氮与速效磷的土壤中，生菜组织中的大量与微量元素总量均减少[26]。可见，土壤贫瘠的条件下(低氮磷条件下)，AMF的作用更显著，这也符合Latef等人[27]的观点。同时，李芳等人[28]也提到AMF能够在非生物胁迫条件下帮助宿主植物提高抗逆性。

综上所述，建植基质中砂比例越高，养分(磷)越易流失，但AMF的作用就越明显，本研究条件下2∶8土砂比基质中，接种Gm或Ri处理基质中有效磷的总量是ck组的1.71，1.76倍，而且渗滤液中磷酸盐离子的总量是ck组的0.65，0.59倍，也就是说AMF在一定程度能够通过增加基质中的有效磷含量并减少渗沥液中的P，从而降低(抑制)了P元素的流失。依据研究结果，我们推荐在养分较为贫瘠的坪床中施用AMF，既可减少养分的流失，又可增加坪床基质中的有效磷含量。另外，本研究只选取了“兰引3号”结缕草作为试验对象，接种摩西管柄囊霉(Gm)，根内球囊霉组(Ri)，得到的结果仍有一定的局限性，不同坪床适宜的基质土砂配比，不同的草坪草种，接种哪些AMF菌剂更为适合等，还需要做大量细致的研究工作。