2,4表-油菜素内酯对低温胁迫下西藏野生垂穗披碱草幼苗抗氧化保护和渗透调节的影响

普布卓玛， 罗艺岚， 高金柱， 孙鹏越， 赵东豪，苗彦军， 付娟娟*， 呼天明*

(1.西北农林科技大学草业与草原学院， 陕西 杨凌 712100； 2. 西藏自治区农科院草业科学研究所， 西藏 拉萨 850000；3. 西藏农牧学院植物科学学院， 西藏 林芝 860000)

青藏高原是世界上隆起最晚、面积最大、海拔最高的高原，因而被称为“世界屋脊”，被视为南极、北极之外的“地球第三级”。西藏高原位于青藏高原的主体区域。平均海拔4 000 m以上，由于地形、地貌和大气环流的影响，气候独特而且复杂多样。研究优良牧草的抗寒性具有非常重要的价值。垂穗披碱草(ElymusnutansGriseb.)是我国青藏高原重要的优质牧草，其营养价值高、分蘖能力强、再生性好、根系发达是一种抗逆性很强的牧草。在畜牧业生产发展与生态环境保护等方面发挥重要的作用[1-4]。

低温作为重要的非生物逆境，会严重影响植物的生长发育以及地理分布，还会对植物造成多方面的损伤，包括生物膜透性增大、活性氧积累引起氧化损伤等，严重时会造成植物的死亡[5-6]。油菜素内酯(Brassinolide,BRs)是一种新型植物内源激素，由于其生理活性大大超过现有的5种激素，已被国际上誉为第六大类激素。研究发现，BRs不仅能够调节植物的生长发育，还能够提高植物对低温等多种抗性。BRs可以诱导多种抗氧化酶如抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)和谷胱甘肽过氧化物酶(Guaiacol peroxidase,GPX)等酶活性增加，增强植物的抗氧化能力，减少膜脂过氧化作用，从而提高植物的低温抗逆性[7]。然而，目前对于BRs调控垂穗披碱草的低温适应机理尚不明晰。

本研究拟以西藏野生垂穗披碱草为研究对象，采用叶面积喷施外源BRs的方法，探究BRs调控西藏野生垂穗披碱草低温适应的生理机制，旨在为BRs调控植物的低温适应性提供新理论。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本供试材料为野生垂穗披碱草采集于西藏拉萨市当雄县(30°28.535′ N，91°06.246′ E，海拔4 618 m)，由西藏大学农牧学院提供。

1.2 试验设计

种子经0.1%(W/V)次氯酸钠溶液消毒，用蒸馏水冲洗数次后，放置于铺有湿润的培养皿中，置于人工气候箱中萌发。待幼苗长至2 cm左右时，选取健康植株转移至培养钵中，采用沙培的方式在人工气候箱中(光通量密度350 μmol·m-2· s-1，光照14 h，25℃，湿度80%；暗期10 h，25℃，湿度60%)进行幼苗培养，期间幼苗每3 d更换一次Hoagland营养液。将预培养21 d的幼苗进行处理，初步设置5个不同浓度梯度(0,0.001,0.01,0.1,1 μmol·L-1)来筛选2,4-表油菜素内酯(EBR)的最佳作用浓度。确定EBR最佳作用浓度后，试验设4个处理：CK (25℃,Hoagland营养液)，低温处理(4℃,Hoagland营养液)，CK+EBR处理(25℃,EBR)，低温+EBR (4℃,EBR)，每处理3次重复，用1 μmol·L-1外源EBR处理釆用叶面喷施的方法，早晚各1次，以叶面刚好打湿为标准(不下滴液体)。低温(4℃)处理5 d后，采集低温处理的样品。

1.3 指标测定

1.4 数据分析

所有数据均用MicrosoftExcel 2003 录入并作图，采用SPSS 19.0软件对数据进行One-way ANOVA进行单因素方差分析，采用Duncan ' s法对平均值进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同浓度EBR处理对低温胁迫下垂穗披碱草幼苗生长、表型和细胞膜损伤的影响

低温处理显著降低了垂穗披碱草幼苗的鲜重，喷施外源EBR能提高幼苗的鲜重。如图1可知，与CK相比，低温处理后幼苗的生长受到抑制，幼苗鲜重显著降低了63.20%(P< 0.05)。T1，T2，T3，T4处理和低温处理相比，分别增加了13.04%，36.96%，28.26%，95.65%，其中在T4的处理效果最好(图b)。电导率可表示质膜透性和质膜受伤害的程度。与CK相比,低温处理后垂穗披碱草叶片中电导率含量显著增加了57.28%(P< 0.05)。与低温处理相比，T1，T2，T3和T4处理叶片相对电导率分别将低了15.07%，18.82%，46.01%和46.38%(P< 0.05)。其中T4的处理效果最好(图c)。

图1 低温(4℃)胁迫下喷施EBR对垂穗披碱草幼苗的表型(a)，幼苗鲜重(b)和相对电导率(c)的影响Fig.1 The effects of EBR on phenotypic characteristics (a),fresh weight (b),and relative conductivity of E.nutans seedlings under low temperature stress注：CK：常温;4℃：低温处理;T1:4℃+0.001 μmol·L-1 EBR;T2:4℃+0.01 μmol·L-1 EBR;T3:4℃+0.1 μmol·L-1 EBR;T4:4 ℃+1μmol·L-1 EBR,不同小写字母表示不同处理之间的差异显著性(P<0.05),下同Note:CK:control;4℃:Low temperature treatment;T1:4℃+0.001 μmol·L-1 EBR;T2:4℃+0.01 μmol·L-1 EBR;T3:4℃+0.1 μmol·L-1 EBR;T4:4℃+1 μmol·L-1 EBR. Different lowercase letters above the columns mean significant difference among different treatments at the 0.05 level,bars represent SE. The same as below

2.2 EBR对低温胁迫下野生垂穗披碱草幼苗叶片中丙二醛(MDA)含量的影响

如图2可知，低温胁迫(4℃)下，垂穗披碱草叶片中MDA含量显著高于CK。与CK相比，低温处理导致垂穗披碱草叶片中MDA含量增加了61.87%(P< 0.05)。而低温胁迫下，叶面积喷施EBR能够显著地降低MDA的积累。4℃+EBR处理中垂穗披碱草叶片中MDA含量较4℃单独处理降低了20.73%(P< 0.05)。而对照条件下喷施EBR与CK无显著性差异(P<0.05)。

图2 喷施EBR对低温胁迫下垂穗披碱草幼苗MDA的影响Fig.2 Effect of EBR on MDA content of E.nutans seedlings under low temperature stress

2.3 EBR对低温胁迫下垂穗披碱草幼苗超氧阴离子自由基的影响

2.4 EBR对低温胁迫下野生垂穗披碱草幼苗叶片中抗氧化酶活性的影响

低温胁迫下，抗氧化酶SOD、APX和GR活性与CK相比呈现增加趋势，而CAT和POD活性则表现为下降趋势(图4)。叶面积喷施EBR和低温胁迫协同作用能够进一步提高SOD、APX、GR和CAT活性。与低温胁迫相比，4℃+EBR处理后垂穗披碱草叶片中SOD，CAT，APX和GR活性分别增加了27.04%，24.65%，45.85%和52.44%。与CK相比，低温处理后垂穗披碱草叶片中APX活性显著增加(图4d)。在CK条件下，叶面积喷施EBR对上述抗氧化酶活性影响较小，与CK处理相比差异未达到显著性水平。

图3 喷施EBR对低温胁迫下垂穗披碱草幼苗超氧阴离子自由基的影响Fig.3 Effect of EBR on content of E. nutans seedlings under low temperature stress

图4 EBR处理低温胁迫下垂穗披碱草幼苗SOD (a)，POD (b)，CAT (c)，APX (d) 和GR (e)活性的影响Fig.4 Effect of EBR on activities of SOD (a),POD (b),CAT (c),APX (d) and GR (e) of E.nutans under low temperature stress

2.5 EBR对低温胁迫下垂穗披碱草幼苗抗坏血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量的影响

低温胁迫下垂穗披碱草叶片中AsA和GSH含量均降低，但与CK未达到差异显著性水平。EBR处理与低温协同处理后，AsA和GSH含量与低温胁迫单独处理相比分别显著提高了45.85%和81.90%(P< 0.05)；而ASA含量在CK下EBR处理对AsA含量影响较小，与CK相比无显著性差异。在CK条件下，叶面积喷施EBR显著提高了GSH含量。与CK相比，外源EBR处理后GSH含量增加43.13%(P<0.05)。

图5 喷施EBR对低温胁迫下垂穗披碱草幼苗抗坏血酸(a)和谷胱甘肽(b)含量的影响Fig.5 Effect of EBR on AsA (a) and GSH (b) content of E. nutans seedlings under low temperature stress

2.6 EBR对低温胁迫下垂穗披碱草叶片中脯氨酸积累的影响

由图5可知，与CK相比，低温胁迫垂穗披碱草幼苗叶片中脯氨酸含量显著增加。低温条件下，喷施EBR能够进一步提高脯氨酸的积累；比4℃处理相比，4℃+EBR处理后脯氨酸含量增加了24.64%。而CK条件下喷施EBR对脯氨酸含量无显著性影响。

图6 喷施EBR对低温胁迫下垂穗披碱草幼苗游离脯氨酸含量的影响Fig.6 Effect of EBR on proline content of E. nutans seedlings under low temperature stress

3 讨论

植物在遭受低温胁迫时,其形态和生理响应等发生改变[12-13]。植物的细胞膜系统是感受低温胁迫的首要部位。低温胁迫导致细胞膜透性增大，膜脂过氧化作用加剧。相对电导率是反映植物细胞膜受逆境损伤的一个重要指标，MDA是膜脂过氧化产物，其含量的多少也能够反应逆境下植物受损伤的程度[14]。本研究结果表明，低温胁迫下垂穗披碱草幼苗叶片中相对电导率和MDA含量增加，叶面积喷施EBR能显著降低了相对电导率和MDA的含量，说明EBR处理能够减轻低温引起的膜脂过氧化作用，从而缓解低温对垂穗披碱草细胞膜造成的伤害。

植物遭遇低温胁迫时，细胞内活性氧代谢失衡，活性氧大量积累，从而造成细胞膜系统发生严重的氧化损伤[15]。为防止细胞内过量积累的活性氧对植物造成的氧化损伤，低温胁迫诱导植物体内抗氧化防御体系活性增加，从而避免或减轻活性氧对植物造成的伤害。抗氧化系统包括抗氧化酶体系和非酶抗氧化体系[16]。抗氧化酶SOD，POD,CAT及AsA-GSH循环能够有效地清除过量积累的活性氧。SOD是植物细胞中第一道抗氧化防线，能够将超氧阴离子自由基转换为过氧化氢(H2O2),POD和CAT能够将H2O2进一步分解，缓解由于活性氧大量积累对细胞的伤害(Mittler 2002)。APX和GR是AsA-GSH循环的关键酶，能够高效的清除细胞内大量积累的活性氧[17]。本研究中，低温下垂穗披碱草幼苗叶片的SOD,APX,GR活性增加，而喷施EBR能够进一步显著地提高这些酶活性并且降低氧自由基含量，表明EBR能够诱导抗氧化酶活性增强，有效地清除大量积累的活性氧，减轻膜脂过氧化程度，从而增强垂穗披碱草的耐寒性。这与甄鹏等[18]研究结果一致，他指出BRs处理可以缓解低温胁迫对苦瓜幼苗造成的生长抑制，减缓叶片中MDA的积累，同时可以显著降低细胞质相对电导率，增强POD和SOD活性。陈善娜等[19]研究也发现，低温胁迫下采用BR预处理可以提高植物POD和SOD活性，减少MDA的积累。低温逆境下较高的AsA和GSH含量有利于维持植物细胞内的活性氧代谢平衡。本研究显示，低温胁迫下叶面积喷施EBR能够提高AsA和GSH含量，这与前人研究结果一致。

脯氨酸作为重要的渗透调节物质有利于维持或降低植物体内细胞渗透势，在保护蛋白质分子、抵御氧化胁迫，减轻低温对细胞膜的伤害等方面具有重要作用[21]。低温胁迫下垂穗披碱草幼苗叶片中游离脯氨酸的含量显著增加。喷施EBR能够进一步促进低温胁迫下垂穗披碱草叶片中脯氨酸的积累。这表明EBR能够通过提高脯氨酸的积累来提高植物的低温抗性，这与前人在其他作物上的研究是一致[20-23]。

4 结论