一株高产抗寄生虫环肽emodepside前体产生菌的鉴定及其次级代谢产物PF1022A的结构分析

童永亮 徐进 刘会明 李宏 别一 刘省伟 郭明

(重庆乾泰生物医药有限公司，重庆 400716)

关键字：分类鉴定；座坚壳属；PF1022A；鉴定结构

Emodepside(艾默德斯)是环八缩酚酸肽类药物，是基于PF1022A的半合成衍生物，PF1022A来自菌株Rosellinia的发酵代谢产物。Emodepside用于线虫，可抑制寄生线虫的肌肉蠕动[1-2]，抑制线虫头部运动和咽部运动，除此之外还对其他组织有影响，如抑制产卵。Emodepside作用机制[2]主要通过与一组称为latrophilin[3-4]的G蛋白偶联受体结合，然后通过信号的逐级放大，抑制线虫体膜相关蛋白UNC-13介导的囊泡释放神经递质，从而麻痹或抑制线虫的吞咽，最终导致有机体的死亡。除了与线虫latrophilin受体结合，emodepside也与线虫基因slo-1编码的BK钾通道蛋白相互作用[5-6]，这些亚基组在一起形成高电导BK型[7-8]通道的膜电位和细胞内钙水平的门控，最终导致钾离子外流，抑制神经递质对突触传递，最终肌肉收缩导致线虫瘫痪或减少吞咽。

Emodepside是由日本制药公司安斯泰来(Astellas)公司开发，目前已被拜耳动物保健公司(Bayer Animal Health)用作猫和狗的抗蠕虫兽药。2014年12月，拜耳公司与DNDi签署了一项合作协议共同开发emodepside，用于治疗人体感染盘尾丝虫引起的“河盲症”。于2016年进入健康志愿者I期研究，2017年完成了单次递增剂量研究，2018年底完成了多次递增剂量研究。DNDi计划将在非洲开展临床II期的研究，初步评价emodepside治疗人体感染盘尾丝虫引起的“河盲症”的安全性和有效性。

本文研究菌株CBR72-MCB-01的分类鉴定以及次级代谢产物PF1022A的结构分析，旨在为抗生素产生菌的开发和利用奠定基础，为以后工业放大生产打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

本实验室通过紫外诱变分离得到一株高产PF1022A的突变株CBR72-MCB-01，现保藏于重庆乾泰生物医药有限公司。

1.2 主要仪器及试剂

光学显微镜(日本Nikon公司)；MyCyclerTMthermal cycler PCR仪(美国Bio-Rad公司)；Gel Doc™XR System凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；超净工作台(苏州安泰公司)；生化培养箱(东联电子公司)；高速冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司)；超低温冰箱(美国Thermo公司)。

试剂包括真菌基因组DNA提取试剂盒(上海生工公司)；琼脂糖凝胶DNA片段纯化回收试剂盒(上海生工公司)；2×TaqPCR Master Mix(Tiangen公司)；其余试剂均为市售分析纯。

1.3 培养基

分类鉴定用培养基采用PDA培养基、MEA培养基和CMM培养基。种子培养基参照文献[9]配方(g/L)：玉米淀粉10.0、葡萄糖10.0、棉籽饼粉5.0、小麦胚芽5.0、黄豆饼粉5.0、酵母粉5.0、硫酸镁1.0、氯化钠2.0和碳酸钙2.0；发酵培养基参照文献[9]配方(g/L)：麦芽糖60.0、豆油10.0、小麦胚芽8.0、黄豆饼粉10.0、酵母粉14.0、硫酸镁2.0、氯化钠2.0、碳酸钙3.0；26度，250r/min摇床培养，培养12d放瓶。

1.4 培养特征实验

接种于PDA培养基、MEA培养基和CMM培养基，于26℃培养7d后，记录菌株的生长状态、基内菌丝和气生菌丝的颜色以及是否有可溶性色素产生。

1.5 显微特征实验

采用平皿插片法，将突变株45度斜插到PDA培养基 上，26℃培养1周，观察试验菌株的基内菌丝及气生菌丝生长特征和孢子的形状，对试验菌株进行显微结构鉴定和形态观察。

1.6 生理生化特征测定

按照参考文献[10]规定的方法，检测突变株的碳源利用 、氮源的利用和无机盐利用等特性。

1.7 ITS rRNA基因序列测定及系统发育分析

参照上海生工真菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取菌株CBR72-MCB-01基因组DNA。合成霉菌ITS rRNA基因的通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行扩增。反应体系：基因组DNA 0.5μL； ITS1 0.5μL； ITS4 0.5μL；2×TaqMasterMix(Dye)25μL；补充超纯水到50ul。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，共进行30个循环；最后72℃延伸6min。反应完毕后凝胶成像系统观察结果。反应体系经PCR片段纯化试剂盒纯化后，PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司单向测序。测得ITS序列通过NCBI网站的BLAST检索系统进行同源序列比对，利用Clustal IW软件进行多序列比对序列分析，采用NJ与MP构建进化树。

1.8 光谱测定

紫外光谱(UV)用岛津紫外分光光谱仪(UV,160A Shimadzu)测定，质谱(MS)用液质联用仪(1100 Series LC/MSD)测定，核磁共振(NMR)用Bruker Avance 600核磁共振仪测定(DMSO-d6，TMS为内标)。

2 结果与分析

2.1 培养特征

菌株在PDA培养基上，菌落0.3～0.8cm，正面呈白色，表面因具气生菌丝凸起，反面呈褐色，无气味，无色素。菌株在MEA培养基上，菌落0.5～1cm，正面呈白色，气生菌丝较薄，反面呈褐色，无气味，无色素。菌株在CMA培养基上，不生长。

2.2 形态特征

斜插法培养突变株，观察菌丝生长。气生菌丝纤细 ，菌丝上生有子囊壳，子囊孢子丰富(图1)。

2.3 菌种鉴定

根据CBR72-MCB-01菌株的培养特性和形态特征，与《真菌鉴定手册》[11]的描述基本一致，将菌株归属于座坚壳属(Rosellinia)。其分类地位是：真菌门(Fungi)、子囊菌纲(Ascomycetes)、鹿角菌目(Xylariales)、鹿角菌科(Xylariaceae)、座坚壳属(Rosellinia)。

2.4 生理生化特征

最适pH5～8，最适生长温度24～28℃。能利用葡萄糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、麦芽糊精、麦芽糖、乳糖等碳源；利用黄豆饼粉、棉籽饼粉、酵母粉、酵母浸粉、小麦胚芽等有机氮源；利用硫酸镁、氯化钠等无机盐。

图1 诱变菌株 CBR72-MCB-01菌丝与子囊孢子(×100)Fig.1 Mycelium and spora morphological characteristic of the strain(×100)

2.5 ITS rRNA序列分析和系统发育树的建立

以提取的CBR72-MCB-01菌株基因组为模板，扩增ITS间隔区，通过PCR产物测序，从GenBank数据库调集的其他菌株的ITS DNA相应序列进行blast序列比对，菌株CBR72-MCB-01的ITS rRNA序列(465bp)与Roselliniasp.MN140C11T相似性最高，其次是Xylariasp.dx-16T和Fungal endophyte WMS1T。基于ITS rRNA序列，以Roselliniasp.11E045T为基点，采用邻位连接法(neighbour-joining)将菌株CBR72-MCB-01与其相似菌构建进化树(图2)，结果显示菌株CBR72-MCB-01与其相似性最高的菌株Roselliniasp.MN140C11T(相似性最高99%)，Xylariasp.dx-16T和 Fungal endophyte WMS1T建树不在一起，而在属簇内形成独立分支，与Roselliniasp.DZ-3-2-1T和Rosellinia aquilaisolate EFS8T进化距离较近，初步推断菌株CBR72-MCB-01可能是属的新种。

2.6 菌株CBR72-MCB-01的分类鉴定结果

基于培养特征、生理生化特征确定菌株CBR72-MCB-01属于座坚壳属(Rosellinia)，与文献[12]报道一致，基于ITS rRNA基因序列分析结果初步推断菌株CBR72-MCB-01可能是座坚壳属的新种。

图2 菌株CBR72 MCB 01基于ITS r RNA序列的以邻接法进化树分析Fig.2 Neighbour-joing phylogenetic tree based on ITS r RNA gene sequences of strain CBR72-MCB-01 and its closest relative species

2.7 代谢产物液相、质谱分析

对CBR72-MCB-01发酵液进行HPLC分析得到色谱图(图3)，进一步通过制备得到4种化合物的粗品(A～D)。进一步通过MS测定，得到化合物A～D的分子量依次为987.46、895.43、971.46和1047.48，只有化合物C符合PF1022A钠盐的分子量，与文献[13]报道的一致(图4～7)。

2.8 结构鉴定

对分子量971.46的化合物C通过核磁共振确定结构，1H和13C核磁共振(NMR)(表1)无畸变极化转移增强谱(DEPT90和135)、同核化学位移相关谱(H-HCOSY)、异核多量子相关谱(HSQC)及异核多键远程相关谱(HMBC)的测定图略。

图3 CBR72-MCB-01发酵液HPLC图谱Fig.3 HPLC analyses of the fermentation broth of CBR72-MCB-01

图4 化合物A质谱分析图Fig.4 MS spectrum of the compound A

图5 化合物B质谱分析图Fig.5 MS spectrum of the compound B

图6 化合物C质谱分析图Fig.6 MS spectrum of the compound C

图7 化合物D质谱分析图Fig.7 MS spectrum of the compound D

表1 化合物C的13C和1H-NMR 化学位移值的归属Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR data assignments of the compound C

续表1

化合物C的紫外、质谱以及核磁共振的1H NMR谱和13C NMR谱的数据均与对照品PF1022A基本一致，且核磁共振数据与文献中报道[14]的PF1022A一致，可以确认化合物C与PF1022A同质，其化学结构式如图8。

3 讨论

本实验室通过紫外诱变筛选到一株高产PF1022A菌株，通过形态观察、生理生化特征鉴定、ITS基因序列对比及系统发育学分析等相结合方法，鉴定突变株CBR72-MCB-01属于座坚壳属(Rosellinia)。通过培养突变株CBR72-MCB-01得到发酵液。进一步通过LC-MS、1H NMR和13C NMR、DEPT90和135、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC分析测定，确定突变株CBR72-MCB-01代谢产物符合PF1022A的结构特征。

图8 化学结构式Fig.8 Structure of PF1022A

PF1022A是合成emodepside必不可少的前体物质，本实验室通过发酵提取纯化而得到，相比化工直接合成PF1022A，优点是工艺简单、成本低、污染少，因此广受关注。公司开发此项目，旨在为兽药产生菌的开发和利用奠定基础，为以后的工业化放大提供依据。

Emodepside是一种有效的驱虫药，与吡喹酮联合使用控制猫和狗的寄生虫感染。目前国内研究较少，由于emodepside潜在的治疗盘尾丝虫病临床价值，加上emodepside目前已批准的化合物[15]、制备[16-17]、部分剂型[18-19]、部分晶型[20]和部分用途已经公开，另外吡喹酮和环缩肽类(包括emodepside)的药物组合物[21-22]也已经公开，所以在中国仿制emodepside的原料药和部分剂型侵权较小。