脱敏煎通过TGF-β1介导的p38MAPK信号途径对大鼠睾丸支持细胞紧密连接的调节作用

浙江中医药大学附属宁波中医院 宁波 315012

免疫性不育在男性不育患者中占较大比例，目前研究认为，血睾屏障（blood-testis barrier，BTB）的损伤或异常开放导致使精子细胞暴露于自身免疫系统，是造成男性免疫性不育的重要因素之一。支持细胞紧密连接（tight junctions，TJs）是 BTB 的基础，而闭合蛋白（Occludin）是最早被鉴定明确的TJs结构膜蛋白，在BTB完整性的维持和开闭的调节中起到重要作用[1]。本课题组前期研究表明，转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1) 能影响 BTB 开闭，其机制与影响Occludin表达有关[2]。p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号途径广泛参与了细胞的生理和病理过程，在应激反应、细胞增殖、分化和凋亡过程中起着重要作用。研究证实，TGF-β1介导的p38MAPK信号途径参与了多种疾病的发生、发展过程[3-4]，但TGF-β1是否通过p38MAPK信号途径调节BTB尚未完全明确。

我院男科崔云教授采用自拟方脱敏煎治疗男性免疫性不育疗效明显，但脱敏煎是否影响上述病理过程尚不明确，因此本研究以原代培养的睾丸支持细胞为对象，试图探讨TGF-β1在男性免疫性不育发病机制中的作用以及脱敏煎可能的药理机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠10只，体质量150～170g，购于上海斯莱克动物有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002]，饲养于浙江中医药大学动物实验中心 [实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0184]。饲养环境室内温度（24±2）℃，相对湿度40%～60%，动物自由进食和饮水，适应性饲养2周后用于实验。

1.2主要试剂和药品 DMEM/F12培养基、胰蛋白酶和胎牛血清均为美国Hyclone公司产品（批号：0781003、SH30848.01B、SV30087.03）；Ⅱ型胶原酶为上海李记生物科技有限公司产品（批号：C5100L0041）；Real-time PCR Master Mix购于TaKaRa公司（批号：BK1101）；羊抗兔IgG抗体为北京百奥莱博科技有限公司产品（批号：BL0817）；人重组 TGF-β1购于美国Abcam公司（批号：GR1900395）；Occludin兔多克隆抗体购于 Santa Cruz公司（批号：sc40403）；p38MAPK兔多克隆抗体购于南京建成生物工程研究所（批号：Ab41205）；p38MAPK抑制剂SB203580购于上海经科化学科技有限公司（批号：421032）。脱敏煎组方药物女贞子、百合、丹参、丹皮、炒黄芩、徐长卿、防风均由本院中药房提供。

1.3主要试剂和仪器 Mx3000P型荧光定量PCR仪为美国Stratagene公司产品，普通PCR仪为德国Roche公司产品，倒置显微镜购于日本Olympus公司。

1.4方法

1.4.1睾丸支持细胞原代培养 睾丸支持细胞的纯化采用差速贴壁法进行，参考文献[5]的方法，采用免疫组化方法检测特异fas配体（fas ligand，FasL）表达对睾丸支持细胞进行鉴定。睾丸支持细胞纯度（%）=（FasL阳性细胞数/细胞总数）×100%，细胞纯度达到90%后用于后续试验。

1.4.2脱敏煎含药血清制备 将脱敏煎组方药物（女贞子 20g、百合 10g、丹参 20g、丹皮 15g、炒黄芩 10g、徐长卿15g、防风10g）加水500mL，浸泡2h后煮沸，文火煎30min，重复2次后，再将药液继续浓缩至100mL，制备成含生药量1g·mL-1的煎剂备用。将10只SD大鼠随机分为脱敏煎组和阴性对照组，每组5只。根据《中药药理研究方法学》[6]中人和实验动物等效剂量比值表计算出大鼠药物等效剂量，再乘以培养基内血清稀释度。即大鼠灌胃量=临床常用剂量×动物等效面积系数×培养基内血清稀释度。脱敏煎组大鼠予脱敏煎剂灌胃，阴性对照组予等量0.9%氯化钠溶液灌胃，两组均灌胃2次/d，连续10d。采血前禁食不禁水12h以上，末次给药后2h心脏取血，静置30min后2 000r/min离心10min分离血清。滤过除菌，-70℃冰箱储存备用。

1.4.3实验分组及处理 将原代培养的睾丸支持细胞分为6组，空白对照组、阴性对照组、p38MAPK抑制剂组、TGF-β1刺激组、TGF-β1+p38MAPK 抑制剂组和TGF-β1+脱敏煎组，每组设5个复孔。收集对数生长期细胞，调整细胞密度为2×106/mL，将细胞接种于6孔板，每孔体积2mL；同时将密度为2.5×106/mL的细胞悬液接种于24孔板，每孔体积0.8mL，当细胞融合约50%后，空白对照组加入终浓度为10%的无菌0.9%氯化钠溶液，阴性对照组加入终浓度为10%的阴性对照组大鼠血清。其余各组细胞依据预实验结果均加入终浓度为5ng·mL-1的重组TGF-β1，TGF-β1+p38MAPK 抑制剂组和 TGF-β1+脱敏煎组在此基础上再分别加入终浓度为 3μmol·L-1SB203580和10%的脱敏煎组大鼠含药血清，各组细胞继续培养12h后备用。

1.4.4双室培养模型的建立及睾丸支持细胞跨膜上皮电阻（trans-epithelial electrical resistance，TER）测定 细胞培养及分组同1.4.3。在24孔板中插入Milicell-PCF型培养内室，相差显微镜下观察单细胞层形成情况，待细胞融合约90%后，应用Milicell-ERS型电阻仪检测双室模型内、外室的TER。TER计算公式：TER=（测定值-空白本底值)∕膜的有效生长面积。

1.4.5Real-time PCR检测睾丸支持细胞Occludin和p38MAPK mRNA表达 细胞培养及分组同1.4.3。收集各组细胞，提取总RNA，总RNA提取与cDNA合成按试剂盒说明书操作，cDNA产物置于-20℃冰箱保存。以β-actin作为内参照进行扩增，反应条件：95℃预变性 10min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，共40个循环。以2-△△CT公式计算目的基因相对表达量，比较各组Occludin和p38MAPK mRNA表达的差异。所有引物均由上海生工公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4.6Western blot检测睾丸支持细胞Occludin和p38MAPK蛋白表达 细胞培养及分组同1.4.3。收集各组细胞，裂解后提取总蛋白，蛋白定量后进行SDSPAGE电泳，将电泳后分离的蛋白电转至硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭后，分别加入Occludin、p38MAPK兔多克隆抗体，4℃过夜，TBST洗涤3次。再加入HRP标记的羊抗兔IgG，室温下反应1.5h，0.1%的TBST洗膜后ECL显色，以β-actin作为内参照，采用Image J 1.48分析软件分析蛋白相对表达量。

1.5统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组细胞TER比较 与空白对照组比较，阴性对照组细胞的TER差异无统计学意义（P＞0.05）。与两个对照组比较，p38MAPK抑制剂组细胞TER差异无统计学意义（P＞0.05），TGF-β1刺激组、TGF-β1+p38MAPK 抑制剂组和TGF-β1+脱敏煎组细胞TER均降低，差异均有统计学意义 (P＜0.01)；与TGF-β1刺激组比较，TGF-β1+p38MAPK抑制剂组与TGF-β1+脱敏煎组细胞TER明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

2.2各组细胞Occludin和p38MAPK mRNA表达比较 与空白对照组比较，阴性对照组细胞Occludin和p38MAPK的mRNA相对表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。与两个对照组比较，p38MAPK抑制剂组细胞Occludin和p38MAPK的mRNA相对表达量差异均无统计学意义（P＞0.05），而 TGF-β1刺激组、TGF-β1+p38MAPK抑制剂组和TGF-β1+脱敏煎组细胞Occludin mRNA相对表达量均明显降低，p38MAPK mRNA相对表达量明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；而与 TGF-β1刺激组比较，TGF-β1+p38MAPK抑制剂组与TGF-β1+脱敏煎组细胞的Occludin mRNA相对表达量明显升高，p38MAPK mRNA相对表达量明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表 3。

表2 各组细胞TER比较Tab.2 Comparison of TER in each group

2.3各组细胞Occludin和p38MAPK蛋白表达比较与空白对照组比较，阴性对照组细胞Occludin和p38MAPK蛋白相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。与两个对照组比较，p38MAPK抑制剂组细胞Occludin和p38MAPK蛋白相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05），而TGF-β1刺激组、TGF-β1+p38MAPK抑制剂组和TGF-β1+脱敏煎组细胞Occludin蛋白相对表达量降低，p38MAPK蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(P＜0.01)；而与TGF-β1刺激组比较，TGF-β1+p38MAPK抑制剂组与TGF-β1+脱敏煎组细胞Occludin蛋白相对表达量升高，p38MAPK蛋白相对表达量降低，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。见表 4、图 1。

表3 各组细胞Occludin和p38MAPK mRNA相对表达量比较Tab.3 Comparison of mRNA relative expression quantity of Occludin and p38MAPK in each group

表4 各组细胞Occludin和p38MAPK蛋白相对表达量比较Tab.4 Comparison of protein relative expression quantity of Occludin and p38MAPK in each group

3 讨论

BTB是阻止精子与免疫系统接触的物理屏障，主要由支持细胞TJs组成。TJs包含多种蛋白成份，其中Occludin蛋白是最早被鉴定出的TJs结构膜蛋白，作为构成细胞间紧密连接复合体的骨架蛋白之一，对于细胞间屏障的维持至关重要。Occludin表达的下降，导致细胞粘附功能的缺失，最终可引起BTB的破坏[7]。支持细胞双室培养模型常用于支持细胞间TJs功能评价，双室模型中支持细胞在通透膜上呈单层柱状生长，胞质部分在顶端，胞核在靠近通透膜的底部。在近膜部分，相邻支持细胞间形成TJs，类似体内BTB的结构，其跨膜上皮电阻值可反映支持细胞间连接的紧密程度。研究表明，促进Occludin表达能升高上皮细胞间TER，使TJs变得更紧密；而封闭Occludin表达可降低TER，使细胞间连接变得松散，影响BTB的功能，最终导致生殖细胞的丢失[8]。

图1 Western blot检测各组细胞Occludin和p38MAPK蛋白表达Fig.1 Expression of Occludin and p38MAPK protein in each group measured by Western blot

Occludin蛋白的表达受到多种因素的调节，其中磷酸化信号通路对Occludin蛋白功能的调节十分重要。p38MAPK是丝蛋白/苏氨酸激酶，能接受受体传递的信号并传递给细胞核内的重要分子，在炎症、应激反应以及细胞增殖、分化和凋亡等过程中起着重要作用，被认为是细胞众多信号传导通路的中转站。研究证实，p38MAPK信号途径可影响睾丸支持细胞和肠上皮细胞的Occludin表达[9-10]。

TGF-β1是间质细胞的一种局部调节因子，广泛参与体内各种病理生理过程，与炎症、创伤、器官纤维化等多种病理过程的发生、发展关系密切。TGF-β1在雄性生殖系统中主要表达于睾丸间质细胞和附睾主细胞，可通过自分泌和旁分泌等方式调节生精细胞、间质细胞及睾丸支持细胞的功能[11-12]。陈艳秋等[13]研究发现，睾丸中TGF-β1表达增强与精子发生障碍关系密切。本课题组前期研究发现，TGF-β1能调节BTB开闭，过量的TGF-β1使Occludin表达下调，但具体机制尚不清楚。本研究显示，在体外培养的睾丸支持细胞中，TGF-β1能使p38MAPK表达升高，Occludin表达降低，同时TER也降低；而与TGF-β1刺激组比较，p38MAPK抑制剂能有效降低p38MAPK表达，同时能使Occludin表达升高并恢复TER。说明TGF-β1可通过p38MAPK信号途径而影响Occludin表达。

传统中医将免疫性不育归属于“不育”“无子”范畴，我院男性科崔云教授通过多年潜心研究，认为本病病位多在肝肾，病因之本为体虚，病因之标在损伤和感染；病机为正虚、邪恋不舍。病机中正虚多为肝肾亏虚，其中肾阴亏虚临床多见；邪恋多为气滞血瘀湿热。崔师认为本症多与瘀、湿有关，“湿热痰瘀”为本病的病机核心[14]。基于以上认识，崔师自拟经验方“脱敏煎”，药用女贞子20g，百合10g，丹参20g，丹皮15g，炒黄芩10g，徐长卿15g，防风10g。全方补肾益气、沥湿化瘀，同时能调节免疫状态[15]，治疗男性不育症获得明显疗效，但具体药理机制不详。传统中医认为“湿热痰瘀”的形成多与外邪有关，如风、寒、湿、（火）热等，相当于生物、物理、化学等多种因素的损伤。外邪引发病理产物积聚，内环境状态的改变，导致机体清除修复机制的障碍，进而形成瘀症。p38MAPK信号途径在此过程中发挥着重要作用，将受体传递的信号传入细胞核内，引发广泛的生物学效应。本研究发现，脱敏煎能有效抑制p38MAPK表达，提示脱敏煎可能通过对p38MAPK信号途径的调节从而影响睾丸支持细胞Occludin表达以及BTB的开闭，同时亦提示脱敏煎可能通过下调p38MAPK的表达而治疗免疫性不育症。

综上所述，本研究发现TGF-β1能通过p38MAPK信号途径而影响Occludin表达，中药方剂脱敏煎能通过影响p38MAPK信号途径调节睾丸支持细胞Occludin表达以及BTB的开闭，但TGF-β1的其他作用途径以及脱敏煎治疗男性不育症的现代药理学机制仍需进一步深入研究。