CoCl2与NaCl交互作用对蚕豆萌发与幼苗生长的影响

陈丽，焦健，朱绍丹，李朝周

(1.甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；3.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070)

NaCl胁迫是植物生长过程中所面临的重要环境胁迫之一，对我国乃至世界范围内的农业存在着广泛而巨大的制约，据联合国教科文组织(UNESCO)和粮农组织(FAO)不完全统计，全世界盐渍土面积约10亿hm2，而我国盐渍土面积占约1亿hm2[1-2].研究表明NaCl胁迫会影响植物生长、光合作用、蛋白合成、能量和脂类代谢等过程，土壤溶液中盐分过量会对植物造成渗透胁迫、离子毒害、营养失衡和氧化胁迫等方面的伤害，最终导致植物光合速率、生物量下降，生长受到抑制，甚至死亡[3-5].盐渍环境下植物根区盐分与养分元素之间的协同或拮抗作用，可能加强或减弱盐分对植物生长和养分吸收的影响程度，从而对植物耐盐性产生影响[6].

钴是土壤及地壳的一种微量元素，通常被认为是植物的有益元素，近年来研究证明它是维生素 B12的主要成分，参与豆科植物根瘤菌的固氮作用、核酸、蛋白质、能量代谢、促进植物的增产，也是人和动物体内必备的微量元素之一[ 7-8].另外，适宜浓度的钴有利于种子萌发、幼苗生长、叶绿素的合成以及光合作用[9-10].因此，开展钴对植物生长发育的相关研究，对改进植物的品质，提高作物对外界不良因素的抵抗力有一定的意义.

蚕豆(ViciafabaL)是我国重要的豆科植物，其产量占世界第一位.中国蚕豆的主要产区在西北地区，而西北地区土地盐渍化比较严重，因此探讨胁迫条件对蚕豆生长的影响,将有利于抗盐碱作物新品种的引种和繁育[4].李朝周等[11]研究发现，CoCl2显著减轻了盐胁迫下苜蓿幼苗叶片多胺氧化酶活性升高、多胺含量下降及脂质过氧化程度的增加，减缓了细胞膜稳定指数的下降，从而表现出一定的保护作用.王建宝等[12]研究表明，低浓度钴可以诱导蚕豆中抗氧化酶活性增强，促进其叶片光合色素含量、光合作用效率提高和植株生长发育，而高浓度钴则表现出相反趋势，抑制蚕豆的光合效率和生长发育.对于在NaCl胁迫环境下，CoCl2对蚕豆种子和幼苗生长的影响国内外研究尚不多见，因此我们试图通过施加不同浓度CoCl2，研究NaCl盐胁迫下蚕豆种子萌发及幼苗生长，探求较适合蚕豆生长的CoCl2浓度范围，为钴盐在盐碱地农作物生产中的应用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料蚕豆品种为‘临蚕5号’，由甘肃省农科院提供种子，试验于甘肃农业大学林木种苗培养室内进行，室内温度为(20±5)℃.

1.2 试验设计

1.2.1 种子发芽试验 试验设置CoCl2浓度为：CK(0)、0.002、0.004、0.006、0.008、0.1、0.012、0.014、0.1、1和10 mmol/L(序号分别T1～T11)，选大小一致且饱满的蚕豆种子，用0.1% HgCl2溶液消毒10 min，蒸馏水漂洗后用蒸馏水浸泡12 h使种皮软化，浸种后的种子每10粒整齐铺入直径120 mm双层滤纸的培养皿中，并将培养皿置于温度为20 ℃，相对湿度为80%的光照培养箱中培养，8 h光照，光照强度为500 μmol/(m2·s)，16 h黑暗.每日用对应浓度的CoCl2的Hoagland营养液浇灌种子2次，每次6 mL，并记录发芽数(以胚芽长度超过种子一半为种子发芽的判断标准).以上处理均重复3次，在发芽后测胚芽、胚根长，发芽数以计算相对胚芽长，相对胚根长，发芽指数和活力指数，以确定适宜的CoCl2浓度范围后，进行盆栽NaCl胁迫试验.

1.2.2 NaCl胁迫下幼苗生长盆栽试验 试验设置4 个CoCl2溶液浓度梯度(发芽试验确定的适宜浓度范围)：CK(0)、0.004、0.008、1 mmol/L.挑选籽粒饱满，无病斑的蚕豆种子，用自来水浸泡1 d，使种皮软化.挑选露白一致的萌发种子均匀播种于直径为15 cm，深度为20 cm装有营养土的塑料花盆中，每盆为20粒，每日用对应CoCl2浓度的Hoagland营养液浇灌100 mL.待幼苗长至第四片真叶完全展开时，开始进行NaCl胁迫处理，设CK(0)、0.2、0.4和0.6 mol/L 4个NaCl胁迫处理，每处理组3次重复，分别用注射器在其根颈部将每组对应NaCl溶液缓慢注入，每盆50 mL，CK加入等量蒸馏水.胁迫处理21 d后，测定蚕豆幼苗株高、基径、叶长、叶宽、叶面积、叶绿素含量、地上部分与地下部分生物量.

1.2.3 相关指标测定及统计方法

发芽率(%)=发芽种子数/试样粒数×100%

相对胚芽长(%)=处理胚芽长/对照胚芽长×100%

相对胚根长(%)=处理胚根长/对照胚根长×100%

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)(Gt为t时间的发芽数，Dt为相应的发芽天数)

活力指数(VI)=GI×S(GI为发芽指数，S为幼苗生长势，指萌发后的幼株高(胚根长和胚芽长)

叶长和叶宽均由游标卡尺测量，叶长为叶枕到叶尖的距离，叶宽为叶片中部最宽处的长度.

叶面积=叶长×叶宽×0.71[13]

叶绿素含量(Chlorophyll)测定采用Lichtenthaler[14]的方法.

将植株分为地上部分和地下部分，用电子天平称量植株鲜质量；再将其置于105 ℃的烘箱中杀青1 h，后置于65 ℃恒温下烘48 h，冷却后称量植株干质量.

R/C=地下部分干质量/地上部分干质量

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 20.0软件对数据进行处理，统计分析和制图，并用Duncan法进行差异显著性分析(P<0.05).

2 结果与分析

2.1 CoCl2对蚕豆种子萌发的影响

表1结果显示，CoCl2对蚕豆种子的萌发具有显著影响.随着CoCl2浓度增大，蚕豆种子发芽率、相对胚芽长、相对胚根长、发芽指数和活力指数均呈先增后减的趋势.在CoCl2浓度小于0.008 mmol/L时，蚕豆种子的发芽率、相对胚芽长、相对胚根长、发芽指数和活力指数均显著高于对照(P<0.05)，分别达到40%、46%、20%、40%、84%.CoCl2浓度为0.1～10 mmol/L时，各项指标远低于T5处理，种子出现了坏种、中毒现象，同时烂根情况也有所增加.以上结果表明，0.008 mmol/L CoCl2有利于促进种子萌发，较高浓度则表现出抑制作用.

表1 CoCl2对蚕豆种子萌发的影响

2.2 CoCl2对NaCl胁迫下蚕豆幼苗生长的影响

2.2.1 株高和基径 由图1可以看出，相同CoCl2处理下，蚕豆幼苗株高和基径随NaCl胁迫的加剧呈不同程度的降低趋势.0.008 mmol/L CoCl2处理下，株高相比CK在0.6 mol/L NaCl胁迫时降至22.22%，基径变化较小；高浓度CoCl2(1 mmol/L)处理组在不同NaCl胁迫下，株高的增幅由1%降至-42.47%；基径由-21%降至-26%.在相同NaCl胁迫下，随着CoCl2浓度的升高，蚕豆幼苗株高和基径基本呈单峰型曲线变化，0.004和0.008 mmol/L CoCl2处理显著(P<0.05)提高了蚕豆幼苗株高和基径(图1)，且在0.6 mol/L NaCl胁迫下，株高较CK组增加了40%、60%，基径增加了5%、22%.表明0.008 mmol/L CoCl2处理显著缓解了NaCl胁迫对蚕豆幼苗的株高和基径生长的抑制，这一现象在重度NaCl胁迫下更明显.

不同小写字母表示同一CoCl2浓度下不同NaCl处理与对照相比有显著差异(P<0.05)；*表示同一NaCl处理下CoCl2浓度升高与对照相比有显著差异(P<0.05).Different lowercases indicate significant difference between NaCl treatment within the same CoCl2 concentration compared with control(P<0.05).* indicates significant difference between higher CoCl2 concentration and ambient CoCl2 level within the same NaCl treatment (P<0.05).图1 CoCl2 对NaCl胁迫下蚕豆幼苗株高和基径的影响(平均值±标准误差，n=3)Figure 1 Effects of CoCl2 on plant height and base diameter of Vicia faba seedlings under NaCl stress(mean±SE,n=3)

2.2.2 叶片形态 由图2可见，不同CoCl2处理下的蚕豆幼苗叶长、叶宽和叶面积随NaCl胁迫加剧均呈降低趋势，叶面积变化差异最显著(P<0.05).随着NaCl胁迫增加，相比CK，0.008 mmol/L CoCl2处理的叶长、叶宽和叶面积降低幅度明显低于其余CoCl2处理，在重度NaCl胁迫下分别降低了16%、24%和46%.说明，较低浓度的CoCl2处理可通过改变叶片形态来缓解盐害，提高植物的抗盐性，而高浓度CoCl2处理则对蚕豆叶片生长有抑制作用.在相同NaCl胁迫条件下，蚕豆幼苗叶长、叶宽和叶面积随着CoCl2浓度的升高，均呈现单峰型曲线变化，在CoCl2为0.008 mmol/L时达到最大.重度NaCl胁迫下， 0.008 mmol/L CoCl2处理组叶长、叶宽、叶面积对比CK分别增长了62%、39%和125%，表明重度盐胁迫下，0.008 mmol/L CoCl2对幼苗叶片生长有显著促进作用(P<0.05)，但作用幅度存在一定差异.

2.2.3 叶绿素含量 如图3所示，随NaCl盐胁迫的加剧，施加较低浓度的CoCl2可以缓解叶绿素含量的下降，0.008 mmol/L CoCl2缓解的效果最为显著，重度NaCl胁迫叶绿素含量相比CK降幅分别为Chl a为14%；Chl b为5%；Chl(a+b)为7%，Chl a /Chl b为9%.而高浓度CoCl2(1 mmol/L)处理组蚕豆幼苗叶片叶绿素含量的变化趋势总体呈下降趋势，与CK基本一致，对NaCl胁迫缓解作用减弱，且在重度NaCl胁迫下叶绿素含量显著降低(P<0.05)，体现出一定的毒害作用.

在相同NaCl胁迫下，随着CoCl2浓度的升高，蚕豆幼苗叶片叶绿素含量主要表现为低浓度促进高浓度抑制效应，并在CoCl2浓度0.008 mmol/L时达到最大值，且显著高于CK和其余处理组(P<0.05).0.6 mol/L NaCl胁迫下，各叶绿素含量在不同CoCl2(0.004、0.008、1 mmol/L)浓度下与CK组对比变化幅度分别为：Chl a为45%、62%、-2%；Chl b为34%、41%和-12%；Chl(a+b)为39%、48%和-29%；Chl a/Chl b为8%、15%和11%.这表明，重度盐胁迫下，0.008 mmol/L CoCl2处理能显著促进蚕豆幼苗叶片叶绿素光合色素的合成，而高CoCl2浓度则显著抑制叶片叶绿素合成或者促进其降解.

不同小写字母表示同一CoCl2浓度下不同NaCl处理与对照相比有显著差异(P<0.05)；*表示同一NaCl处理下CoCl2浓度升高与对照相比有显著差异(P<0.05).Different lowercases indicate significant difference between NaCl treatment within the same CoCl2 concentration compared with control(P<0.05).* indicates significant difference between higher CoCl2 concentration and ambient CoCl2 level within the same NaCl treatment (P<0.05).图2 CoCl2 对NaCl胁迫下蚕豆幼苗叶片形态的影响Figure 2 Effects of CoCl2 on leaf morphology of Vicia faba seedlings under NaCl stress

2.2.4 地上部分及地下部分(根系)干质量 如图4所示，随着NaCl胁迫加剧，0.008 mmol/L CoCl2处理组生物量相比其余CoCl2处理组降低幅度较小，地上部分干质量呈下降趋势，地下部分干质量和R/C则呈现先增后减的趋势，在重度(0.6 mol/L)NaCl下，地上部分干质量低于CK 20%；地下部分干质量低于CK 9%；R/C则高于CK 18%.0.6 mol/L NaCl胁迫下，1 mmol/L CoCl2处理组，比0.008 mmol/L CoCl2处理组地上部分干质量减少29%；地下部分干质量降低44%；R/C降低22%.说明蚕豆幼苗的生物量随着NaCl浓度增加而降低，而适当浓度CoCl2可缓解盐胁迫的伤害，提高蚕豆的生物量，且在0.008 mmol/L时保护效果较好；各处理组地上部分与地下部分生物量变化不同步，存在一定差异.

相同NaCl胁迫下， 0.4 mol/L、0.6 mol/L NaCl处理蚕豆幼苗的地上干质量和地下干质量随着CoCl2浓度升高而总体呈现先增后减的趋势，且地上部分干质量比地下部分干质量变化显著，R/C变化趋势则与地上部分干质量相反.0.6 mol/L NaCl处理下,对比CK,蚕豆幼苗的地上部分干质量、地下部分干质量和R/C在不同CoCl2(0.004、0.008、1 mmol/L)浓度下变化幅度分别为：地上部分干质量为6.32%、31.84%、和-5.79%；地下部分干质量为73.91%、78.26%、-0.87%；R/C为63.58%、35.21%和5.22%.这表明，重度NaCl胁迫下，0.008 mmol/L CoCl2可以促进蚕豆幼苗地上部分，尤其显著促进地下部分生物量的累积，显著提高R/C(P<0.05)，增强幼苗的抗盐性，较高浓度的CoCl2则会加强盐胁迫的危害.

3 讨论与结论

植物对外界环境最直接的反应是在种子萌发期及幼苗生长期，植物萌发期的状态会对幼苗生长期的生长及生物量造成严重的影响，决定着作物的生长以及产量[15].有研究表明，钴元素对一些植物有促进的作用，且能缓解在逆境下对植物的伤害作用[16]，如甘草、苜蓿[8,11]、玉米及小麦[9,17]等，且出现了“低促高抑”的现象[18].本研究的蚕豆种子发芽试验结果与前人研究基本一致，表现为随着CoCl2的浓度增加，蚕豆种子的发芽率，胚芽胚根长，发芽指数和活力指数都呈显著的先增后减的趋势，且以低浓度0.008 mmol/L CoCl2有利于促进种子萌发.在NaCl胁迫下，较低浓度的CoCl2对增强植株的抗盐性有一定的作用，但浓度高于1 mmol/L时则会抑制幼苗生长，加速植株的衰老过程.

不同小写字母表示同一CoCl2浓度下不同NaCl处理与对照相比有显著差异(P<0.05)；*表示同一NaCl处理下CoCl2浓度升高与对照相比有显著差异(P<0.05).Different lowercases indicate significant difference between NaCl treatment within the same CoCl2 concentration compared with control(P<0.05).* indicates significant difference between higher CoCl2 concentration and ambient CoCl2 level within the same NaCl treatment (P<0.05).图4 CoCl2 对NaCl胁迫下蚕豆幼苗地上部分与地下部分干质量的影响Figure 4 Effects of CoCl2 on ground and underground dry weight of Vicia faba seedlings under NaCl stress

植物通过叶绿素进行光能的吸收、传递和转化，同时叶绿素含量也是植物受伤害程度的重要标志[2].本研究表明，叶绿素含量在轻度NaCl胁迫下无刺激增长，且随胁迫加剧而显著下降，这与前人的研究结果稍有差异，即低浓度盐碱胁迫能刺激叶绿素合成，高浓度则会使叶绿素合成受阻，导致叶绿素含量下降，进而影响植物的光合作用能力，使得植物对抵抗外界环境的能力降低[5,19-20]；施加 0.008 mmol/L CoCl2处理促进蚕豆幼苗Chl a、Chl b和Chl( a+ b)含量升高，表现出了低剂量的刺激效应，说明低浓度的钴能维持NaCl胁迫下蚕豆叶片有较高的叶绿素含量，从而增加叶片的光合性能，对NaCl胁迫下叶绿素的降低起到一定的缓解作用[12].1 mmol/L CoCl2处理显著降低其含量；而 Chl a/Chl b在1 mmol/L CoCl2时却升高，由于在NaCl胁迫下，Chl a的下降明显高于Chl b，导致Chl a/Chl b增加，且Chl a(蓝绿色)的累积速度高于Chl b(黄绿色)的累积速度，茎叶颜色变暗，这与试验中观测的颜色基本一致.由此表明，低浓度的CoCl2溶液可增强蚕豆幼苗合成叶绿素的能力，从而表现出显著的保护作用[17-18]，且适当浓度CoCl2处理能够促进蚕豆幼苗叶绿素的生物合成,保护植物组织的光合作用，从而减轻NaCl胁迫的毒害,维持蚕豆幼苗正常生长发育.

生物量是植物对NaCl胁迫反应的综合体现，即对NaCl胁迫的综合适应，也是植物耐盐性的直接指标[21].本研究表明，蚕豆幼苗地上与地下部分生物量随NaCl胁迫增大而降低，这与前人的研究结果较为一致[22-23]，0.008 mmol/L CoCl2明显减缓了盐胁迫对地上部分干质量与地下部分干质量的危害，使R/C显著提高，大量研究表明，根冠比R/C值的增大有利于提高植物对水分的利用率，是作物对盐的一种适应，在盐胁迫下植物根系生长的敏感性要低于地上部分，使得根冠比R/C会增加[20,22].因此，NaCl胁迫下施加较低浓度的CoCl2溶液，更有利于蚕豆幼苗生物量的积累和根系的纵深发展，同时提高对土壤深层水分的利用率.

综合结果表明，低浓度CoCl2对蚕豆幼苗的发芽率、相对胚芽长、相对胚根长、发芽指数和活力指数有显著的促进作用，而高浓度则相反.NaCl胁迫下，低浓度CoCl2溶液(小于1 mmol/L)对蚕豆幼苗株高、叶长、叶绿素含量、地下部分生物量有一定的促进作用，可增强植株的抗盐性，且以CoCl2浓度为0.008 mmol/L时表现较为突出，而高浓度CoCl2溶液(大于1 mmol/L)会抑制其生长，且对蚕豆毒害作用较大.因此，可通过喷施低浓度Co2+溶液增强蚕豆在盐区适应性，从而有助于蚕豆产量提高.