锁阳乙醇提取物对运动小鼠抗疲劳能力的影响

万丽娜,王劼,杜玉枝,孙菁,孟卫东,卢学峰,周玉碧

(1.中国科学院藏药研究重点实验室，中国科学院西北高原生物研究所，青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室，青海 西宁 810001；2.中国科学院大学，北京 100049；3.青海道康农牧科技有限公司，青海 都兰 816100)

疲劳是机体生理机能减退的一种现象，造成这一现象的原因多种多样[1].1982年第五届国际运动生化会议统一了疲劳的概念[2].据WHO调查，全球有35%以上的人处于疲劳状态，中年男性人群疲劳状态达60%[3].随着生活压力的增大，疲劳已成为影响人们生活质量的重要因素.疲劳发生后，如得不到及时消除，则易导致机体内环境紊乱、免疫力下降、大脑反应迟钝、甚至出现器质性病变，如:帕金森病、中风等[4].因此，如何缓解疲劳，实现高质量的生活成为人们研究的热点.越来越多的证据表明，不同中药材中的提取物，如竹节人参提取物、黄秋葵水提取物、黄芪提取物、野生水芹提取物在抗疲劳方面均具有较好的功效[5-8].

锁阳(CynomoriumsongaricumRupr.)为锁阳科锁阳属植物，多年生肉质寄生草本，多寄生于白刺属植物的根上[9-10]，主要分布于青海、内蒙古、甘肃、宁夏和新疆等荒漠化地区[11].锁阳是我国珍贵的传统中药材，素有“沙漠人参”的美称[12]，与肉苁蓉并称为“大漠双雄”[13].锁阳中含有蛋白质、脂肪、无机离子及糖类等人体所需的重要营养成分，同时锁阳中还含有丰富的三萜类、甾体类、黄酮类、鞣质和有机酸等多种活性成分[14-16].近年来随着现代药理学研究表明，锁阳有增强免疫[17]、抗氧化[18]、抗衰老[19]、抗应激[20]、清除自由基[21]、抑制血小板凝集[22]等作用，且对心血管疾病有显著疗效[23].

研究表明甘肃产锁阳黄酮对大鼠有增强运动耐力、提高机体抗氧化、抗疲劳等方面的作用[24]，甘肃产锁阳水煎剂可提高机体抗疲劳能力[25-26]；熊正英等[27]研究结果表明，锁阳多糖具有抗疲劳作用.尽管针对锁阳抗疲劳方面的研究已有报道，但针对青海产锁阳的抗疲劳功效研究还未见报道[28].锁阳是青海省著名的道地药材,资源储量大，具有极大的开发价值[29].因此，本试验以采自于青海都兰的锁阳为原料，探究锁阳乙醇提取物在小鼠抗运动性疲劳方面的作用，以期为我国西部地区锁阳资源的开发利用提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验动物

昆明种小鼠60只，SPF级，雌雄各半，体质量(20±2) g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供.小鼠饲养于SPF级动物室，喂饲全价颗粒饲料.饲养条件湿度为50%～80%，温度21～23 ℃，每12 h明暗循环.

60只小鼠适应性喂养3 d后，随机分为6组，每组10只，雌雄各半，分别为模型对照组(超纯水)，锁阳乙醇提取物低剂量组(0.125 g提取物/mL)、锁阳乙醇提取物中剂量组(0.25 g提取物/ml)、锁阳乙醇提取物高剂量组(0.5 g提取物/mL)，红景天口服液阳性对照组，维生素E软胶囊阳性对照组.

1.2 药物与试剂

红景天口服液产自阿坝州九寨生物科技有限公司，维生素E软胶囊产自青岛双鲸药业有限公司，锁阳乙醇提取物由本课题组自行制备，质量浓度为0.125、0.25、0.5 g/mL.ATP(武汉基因美科技有限公司，货号JYM0723Mo)；肝糖原(南京建成生物工程研究所，批号20171218)；肌糖原(南京建成生物工程研究所，批号20171218)；血糖(苏州科铭生物技术有限公司，批号20171221)；BUN(苏州科铭生物技术有限公司，批号20171221)；LD(南京建成生物工程研究所，批号20171218)；MDA(武汉基因美科技有限公司，货号JYM0345Mo)；CK武汉基因美科技有限公司，货号JYM0627Mo).

1.3 主要仪器与设备

离心机(3K15，美国Sigma公司)；恒温干燥箱(上海—恒科学仪器有限公司)；超纯水器(Milli-QA-10，美国Millipore公司)；循环水真空泵(SHZ-Ⅲ，上海亚荣生化仪器厂)；电子天平(AL104，上海天平仪器总厂)；多功能酶标仪(EnSpire，珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司)；可见分光光度计(722，上海棱光技术有限公司)；游泳箱；有机玻璃杆；记时器；温度计；直尺.

1.4 试验方法

1.4.1 锁阳乙醇提取物的制备 锁阳采自青海省都兰县，由中国科学院西北高原生物研究所卢学峰研究员鉴定为锁阳科锁阳属锁阳(CynomoriumsongaricumRupr.)的干燥肉质茎.清洗，晾干，取已晾干的锁阳茎1 000 g粉碎，用75%乙醇提取，固液比1∶4，提取温度80 ℃，提取6次，分别为8、8、6、6、6、6 h，将每次提取液合并后，利用负压回流浓缩提取液，获得浓缩液，然后将浓缩液至于80 ℃烘箱中烘干，备用.

1.4.2 药物处理 将锁阳乙醇提取物用超纯水配成药物浓度为0.125，0.25，0.5 g/mL的溶液，记为锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量；红景天口服液拆除包装后直接取用；维生素E软胶囊去除胶囊外壳后使用；超纯水直接取自纯水机.

1.4.3 动物给药 每天上午固定时间按小鼠体质量比例给药一次,锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量组每次均给予15 mL/kg，模型对照组小鼠用等体积超纯水进行灌胃，红景天口服液阳性对照组每次给予7 mL/kg，维生素E软胶囊阳性对照组每次给予5 mL/kg，连续灌胃给药.

1.4.4 体质量测量 分组方法同1.4，给药方法同2.3，连续灌胃给药14 d后，用电子秤称量体质量，与给药前的体质量进行比较(禁食不禁水12 h).

1.4.5 抗疲劳试验

1.4.5.1 小鼠爬杆试验 分组方法同1.4，给药方法同2.3，连续灌胃给药14 d，末次给药30 min后(禁食不禁水12 h)，将小鼠放于一根垂直固定的直径8 mm，长120 cm的有机玻璃杆上，使肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从玻璃棒上跌下的时间，联系悬挂3次，第3次跌落时终止试验，累计3次的时间作为小鼠爬杆时间，记录数据.

1.4.5.2 小鼠负重游泳试验 分组方法同1.4，给药方法同2.3，连续灌胃给药14 d，末次给药30 min后(禁食不禁水12 h)，于小鼠尾部系一质量为其体重5%的重物，将小鼠置于水温为 (25±1) ℃，水深为30 cm，游泳面积114.8 cm2/只的游泳箱中，强迫游泳至力竭，以小鼠游泳至死亡结束，记录时间作为小鼠负重游泳时间.

1.4.5.3 生化指标检测 分组方法同1.4，给药方法同2.3，连续灌胃给药14 d，末次给药30 min后(禁食不禁水12 h)，将小鼠置于水温为(25±1) ℃，水深为30 cm，游泳面积114.8 cm2/只的游泳箱中，游泳90 min后将小鼠捞起，即刻进行摘眼球采血备用.将所采血液常规分离血清，4 ℃ 3 000 r/min离心20 min，取上清液待测.肝糖原、肌糖原含量的测定采用蒽酮试剂法，血糖含量的测定采用葡萄糖氧化酶法，BUN含量的测定采用Fearon反应，ATP、MDA、CK采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验进行含量测定，LD采用比色法进行含量测定.

肝糖原、肌糖原、LD指标测定采用可见分光光度计完成，其余指标测定均采用EnSpire多功能酶标仪检测完成.

1.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 锁阳乙醇提取物对小鼠体质量的影响

锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量进行灌胃给药14 d后，与模型组相比，体质量均有所增加，但差异均不显著(P>0.05)，说明该剂量锁阳乙醇提取物处理对小鼠肌肉质量和体质量影响不大；组间两两比较差异均不显著(P>0.05)(表1).

2.2 锁阳乙醇提取物对小鼠爬杆及负重游泳时间的影响

在小鼠爬杆及负重游泳试验中，与模型对照组比较，锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量组均能明显延长小鼠爬杆及负重游泳时间，差异具有统计学意义(P<0.01).锁阳乙醇提取物高剂量组与维生素E软胶囊阳性对照组相比，在延长小鼠爬杆及负重游泳时间上能力相近(P>0.05).锁阳乙醇提取物(中、高)剂量组在延长小鼠爬杆及负重游泳时间上与锁阳乙醇提取物低剂量组有显著差异(P<0.05)，见表2.

组别Group给药前体质量/gBody mass before administration给药后体质量/gBody mass after administration模型对照组Model control group19.9±5.9a30.4±3.1a锁阳乙醇提取物低剂量组Low dose group of ethanol extract of C.songaricum22.1±2.5a30.5±3.6a锁阳乙醇提取物中剂量组Middle dose group of ethanol extract of C.songaricum21.9±2.0a31.3±3.4a锁阳乙醇提取物高剂量组High dose group of ethanol extract of C.songaricum19.2±5.8a30.9±4.1a维生素E软胶囊阳性对照组Vitamin E soft capsule positivecontrol group21.6±2.5a30.1±4.0a红景天口服液阳性对照组Rhodiola oral liquid positive control group22.4±1.8a30.7±4.4a

组别Group爬杆时间/minClimbing time负重游泳时间/minWeight-bearing swimming time模型对照组Model control group44.6±16.378.3±7.7锁阳乙醇提取物低剂量组Low dose group of ethanol extract of C.songaricum48.3±10.1c**88.4±9.6c*锁阳乙醇提取物中剂量组Middle dose group of ethanol extract of C.songaricum70.2±8.4b**98.0±14.4b**锁阳乙醇提取物高剂量组High dose group of ethanol extract of C.songaricum79.7±15.9b**105.9±17.3ab**维生素E软胶囊阳性对照组Vitamin E soft capsule positivecontrol group78.8±13.1b**101.0±16.2ab**红景天口服液阳性对照组Rhodiola oral liquid positive control group111.6±25.8a**113.0±21.6a**

与模型对照组比较*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

Compared with model control，* means significant difference (P<0.05)；** means extremely significant difference (P<0.01).The different letters in the same column means significant difference (P<0.05).

2.3 锁阳乙醇提取物对疲劳小鼠肝糖原、肌糖原、血糖的影响

由表3所示，通过检测发现，与模型对照组比较，锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量组能显著增加小鼠血糖、肝糖原、肌糖原含有量(P<0.01)，表明锁阳乙醇提取物具有促进糖原储备的作用，从而有利于机体对抗运动性疲劳.锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量组与维生素E软胶囊、红景天阳性对照组相比，在增加疲劳小鼠肝糖原、肌糖原、血糖含量上能力相近(P>0.05).锁阳(低、中、高)剂量组在增加疲劳小鼠肝糖原、血糖含量上差异不明显(P>0.05)；在增加疲劳小鼠肌糖原含量上，锁阳高剂量组与锁阳(低、中、)剂量组存在显著差异，结果见表3.

组别Group肝糖原/(mg·g-1)Hepatic glycogen肌糖原/(mg·g-1)Muscle glycogen血糖/(μmol·mL-1)Blood sugar模型对照组Model control group12.3±0.413.3±1.01.1±0.2锁阳乙醇提取物低剂量组Low dose group of ethanol extract of C.songaricum16.9±2.0b**15.7±1.0c**2.2±0.5b**锁阳乙醇提取物中剂量组Middle dose group of ethanol extract of C.songaricum17.4±2.6b**16.6±1.4c**2.4±0.6b**锁阳乙醇提取物高剂量组High dose group of ethanol extract of C.songaricum17.7±2.9b**21.0±2.5ab**2.5±0.9b**维生素E软胶囊阳性对照组Vitamin E soft capsule positive control group18.6±2.3ab**20.2±1.8b**3.3±0.8a**红景天口服液阳性对照组Rhodiola oral liquid positive control group20.7±2.2a**22.3±2.2a**3.5±0.6a**

与模型对照组比较*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

Compared with model control，* means significant difference (P<0.05)；** means extremely significant difference (P<0.01).The different letters in the same column means significant difference (P<0.05).

2.4 锁阳乙醇提取物对疲劳小鼠BUN、CK的影响

通过检测发现，与模型对照组比较，锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量组能极显著降低小鼠CK含有量(P<0.01)，提示锁阳乙醇提取物对小鼠力竭游泳后肌肉损伤有较好的保护作用；锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量组能显著降低小鼠BUN含有量(P<0.05)；锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量组与维生素E软胶囊、红景天阳性对照组相比，在降低疲劳小鼠BUN、CK含量上能力相近(P>0.05).锁阳乙醇提取物不同剂量组之间在降低CK、BUN含量上差异不明显，结果见表4.

组别Group尿素氮/(mg·g-1)BUN肌酸激酶/(ng·mL-1)CK模型对照组Model control group1.5±0.34.4±0.8锁阳乙醇提取物低剂量组Low dose group of ethanol extract of C.songaricum1.0±0.5a*2.4±0.5a**锁阳乙醇提取物中剂量组Middle dose group of ethanol extract of C.songaricum1.0±0.3*a2.2±0.7a**续表4 Continued table 4组别Group尿素氮/(mg·g-1)BUN肌酸激酶/(ng·mL-1)CK锁阳乙醇提取物高剂量组High dose group of ethanol extract of C.songaricum0.7±0.4a**2.0±0.5a**维生素E软胶囊阳性对照组Vitamin E soft capsule positive control group0.9±0.5a**2.3±0.5a**红景天口服液阳性对照组Rhodiola oral liquid positive control group0.7±0.5a**1.9±0.1a**

与模型对照组比较*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

Compared with model control，* means significant difference (P<0.05)；** means extremely significant difference (P<0.01).The different letters in the same column means significant difference (P<0.05).

2.5 锁阳乙醇提取物对疲劳小鼠LD、ATP、MDA的影响

通过检测发现，与模型对照组比较，锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量组能极显著降低小鼠LD含量(P<0.01)，且不同剂量组之间差异显著；锁阳乙醇提取物(低、中、高)剂量组极显著增加了小鼠ATP含量(P<0.01)，且锁阳乙醇提取物高剂量组与锁阳乙醇提取物(低、中)剂量组存在明显差异；锁阳乙醇提取物中、高剂量组能显著降低小鼠MDA含有量(P<0.05)，说明锁阳乙醇提取物能提高力竭游泳小鼠抗氧化及抗疲劳能力.与阳性对照组比较，在降低疲劳小鼠血清中LD含量以及增加ATP含量上，锁阳乙醇提取物各剂量组与维生素E软胶囊阳性对照组相比能力相近(P>0.05)，结果见表5.

组别Group乳酸/(mmol·L-1)LD三磷酸腺苷/(ng·mL-1)ATP丙二醛/(ng·mL-1)MDA模型对照组Model control group17.5±1.615.5±1.1139.8±17.2锁阳乙醇提取物低剂量组Low dose group of ethanol extractof C.songaricum14.1±0.9a**18.4±2.7b*131.8±21.1a锁阳乙醇提取物中剂量组Middle dose group of ethanol extract of C.songaricum8.4±1.7b**19.0±3.5b**121.3±8.8a*锁阳乙醇提取物高剂量组High dose group of ethanol extractof C.songaricum6.6±1.2c**20.35±2.5ab**121.7±15.1a*维生素E软胶囊阳性对照组Vitamin E soft capsule positive control group6.2±1.3cd**20.9±4.7a**68.2±5.8b**红景天口服液阳性对照组Rhodiola oral liquid positive control group5.2±1.6d**22.4±2.8a**76.6±20.7b**

与模型对照组比较*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

Compared with model control，* means significant difference (P<0.05)；** means extremely significant difference (P<0.01).The different letters in the same column means significant difference (P<0.05).

3 讨论

力竭时间是衡量机体运动能力的重要指标，运动能力的提高表明机体抗疲劳能力的增强[30].在抗疲劳研究领域中，常以负重游泳力竭时间来反映机体的运动耐力，机体运动耐力的提高，则可直接反映机体抗疲劳能力的增强.本研究通过爬杆实验、负重游泳试验发现锁阳乙醇提取物能明显延长小鼠的运动时间，说明在一定剂量下，锁阳乙醇提取物能提高小鼠运动耐力，具有一定的抗运动性疲劳的作用.

本试验测定了与疲劳密切相关的肝糖原、肌糖原、血糖、BUN、LD、ATP、MDA、CK八项生化指标.血糖水平不仅可以用来反映机体的糖代谢水平，还可以反映中枢疲劳状况[31].通常情况下，机体血糖浓度保持在一定的平衡状态，但在激烈运动过程中，血糖大量消耗且得不到及时补充时，血糖水平会逐渐下降.与模型组比较，锁阳乙醇提取物低、中、高剂量组能显著增加小鼠体内血糖含量，说明锁阳乙醇提取物可改善疲劳后的能量供应，具有一定的抗疲劳功效.糖原是机体运动的主要能量来源，可以通过肝糖原、肌糖原的储备量来说明疲劳产生的快慢或程度.与模型组比较，锁阳乙醇提取物低、中、高剂量组可显著增加小鼠体内肝糖原和肌糖原的含量，进而说明锁阳乙醇提取物可通过提高小鼠游泳力竭后的糖原储备能力，有一定缓解小鼠运动性疲劳产生的作用.

机体运动时所需能量直接来源于ATP的分解，开始运动时，机体首先以消耗ATP为主，ATP含量的高低可直接衡量机体的供能状态和运动能力.与模型组比较，锁阳乙醇提取物低、中、高剂量组显著增加了小鼠血清中的ATP含量，为运动小鼠直接提供了能量来源，有一定抗小鼠运动性疲劳产生的作用.

乳酸是丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下还原生成的一种酸性代谢产物，乳酸堆积是生理性运动疲劳产生的重要原因之一.尿素氮是氨基酸和蛋白质代谢的终产物，与机体疲劳程度以及负荷量的大小密切相关且呈正相关，可被用来作为评定运动量的指标[32].一般在短时运动时，蛋白质不参与机体供能，当长时间剧烈运动使正常的能量代谢平衡受到破坏，机体不能通过糖或脂肪分解获得足够的能量时，机体便会增加蛋白质和氨基酸的分解代谢用以供能.与模型组比较，锁阳乙醇提取物低、中、高剂量组显著降低了运动小鼠体内LD的产生，减少了代谢产物的堆积，同时显著降低了BUN水平，减少了体内蛋白质和氨基酸的分解代谢，具有改善能量代谢，加速疲劳消除的作用.

CK主要存在于细胞质和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，当肌膜严重损伤或细胞膜通透性改变时，骨骼肌中的CK会通过细胞膜渗出并进入血液中，使得血清中的CK含量升高.运动后可导致CK明显增高，且运动越剧烈、时间越长，CK升高越明显，因此血清中的CK含量可间接反映出机体运动肌肉损伤程度[33].锁阳乙醇提取物低、中、高剂量组可降低游泳小鼠血清中CK的含量，对运动肌肉损伤有一定的保护作用.MDA是脂质过氧化的终产物，其含量既可以反映机体内发生脂质过氧化的程度，也可以反映生物膜的受损程度.锁阳乙醇提取物低、中、高剂量组MDA含量均显著低于模型对照组，说明锁阳乙醇提取物低、中、高剂量组可以消除自由基的攻击，降低力竭及恢复状态下MDA的生成，保护机体，对延缓运动性疲劳的发生有积极的作用[34].

综上所述，锁阳乙醇提取物可在一定程度上通过增强小鼠运动耐力，改善小鼠力竭游泳后氧化应激和能量代谢能力，有显著抗疲劳作用.