维生素E对果蝇辐射氧化损伤机制的影响

贺特 马云 王五洲 贺俊彦 蒋雨薇 曹旭琴 何淑雅,

1南华大学衡阳医学院生物化学与分子生物学教研室 421001；2南华大学公共卫生学院放射医学教研室，衡阳 421001

辐射与各种化学物质结合造成的危害是现代生活不可避免的[1]。在日本福岛核事故等核灾难发生后，由于环境受到放射性污染，公众对辐射暴露的健康风险越来越关注。在毒理学研究中，动物模型被广泛地应用。然而，其成本和许可等问题限制了其在大规模药物筛选过程中被使用[2]，为了尽量减少使用高等动物，替代模型变得非常重要。果蝇是一种无脊椎动物，基因组被广泛研究，且果蝇是一种完全变态的生物体，其毒性可在胚胎、幼虫、蛹和成虫的不同发育阶段表现出来[3]。因此，果蝇适合作为动物模型而应用于大规模药物筛选。

电离辐射对果蝇的大部分有害影响主要是通过它的间接作用，即通过作用于水分子产生自由基，如羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢等，从而使果蝇体内各种生物大分子（如 DNA、RNA 和蛋白质等）的结构和功能发生改变，最终导致致命性的细胞损伤，这是果蝇辐射损伤的主要形式[4]。有研究报道线粒体是细胞内超氧化物产生的主要场所，且同时维生素E在线粒体中的浓度也是最高的，维生素E缺陷型动物的骨骼肌细胞最早出现的症状之一就是线粒体的损坏[5]。线粒体中维生素E的存在对限制超氧化物的生成起着关键作用。维生素E可以通过降低细胞中线粒体超氧化物的生成、清除已生成的超氧化物和稳定线粒体膜，达到降低线粒体超氧化物水平的目的[6]。本研究主要目的是评估维生素E是否能够提高果蝇幼虫的抗辐射损伤和抗氧化损伤的能力。鉴于维生素E具有抗氧化作用，确定维生素E是否可以作为哺乳动物的辐射保护剂具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

试剂：3-羟基苯甲酸甲酯（上海生工生物工程有限公司），冰醋酸、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾（湖南汇虹试剂有限公司），维生素E（北京博奥拓达科技有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物有限公司），过氧化氢酶（catalase，CAT）活力测定试剂盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量测定试剂盒（南京建成生物工程有限公司）。仪器：137Cs γ生物辐照仪（HXFSIA，中国核动力研究设计院设备制造厂），Synergy TMHT酶标仪（美国BIO-TEK公司），Eppendorf冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司），-80℃超低温冰箱（美国Thermo scientific公司）。

1.2 果蝇幼虫的培养

W-118野生型果蝇由湖南师范大学生命科学院吴秀山教授惠赠。果蝇从胚胎发育到成虫大约需要10 d。收集受精的雌性果蝇，产卵限制在4 h，丢弃雌性果蝇，以获得均匀样品。卵在培养室中孵育72 h，用20%蔗糖溶液以梯度密度把幼虫从培养基中分离，获得第二龄幼虫。将幼虫放至装有蔗糖培养基溶液的玻璃瓶中，备用。

1.3 维生素E处理

在装有滤纸盘和在10%蔗糖溶液中添加3.5 mL浓度分别为0、100、500、1000、1500 mg/L维生素E溶液，对幼虫进行24 h处理。每12 h更换一次滤纸，24 h后收获第三龄幼虫。

1.4 分组及照射

将培养瓶中的三龄幼虫分为10组，每组3管，每管100只。将2个5组分别分为对照组和100、500、1000、1500 mg/L维生素E组，其中1个5组放置于生物辐照仪中进行照射，每分钟辐照剂量约为1.9 Gy，辐照50 Gy；另1个5组不进行照射，将未受照射和照射后的果蝇同时放在25℃的恒温箱中培养，每5 d更换一次培养基。

1.5 蛹化率和羽化率的测定

每隔6 h观察照射后幼虫的形态变化，以确定蛹化率和羽化率。蛹化率=蛹的总数/幼虫数×100%，羽化率=羽化果蝇的总数/幼虫数×100%。

1.6 羽化后48h死亡率的测定

在幼虫羽化为成虫后，每隔12 h观察其存活数量直至48 h，以确定死亡率。死亡率=死亡果蝇的总数/羽化果蝇的总数×100%。

1.7 果蝇攀爬能力的测定

收集羽化后4～5 d的成虫，轻拍培养管使果蝇置于培养管底部，果蝇攀爬的运动区域设定为培养管底部距顶部棉塞5 cm 之间的区域，记录10 s内果蝇攀爬到5 cm的百分比。

1.8 氧化应激的标记检测

采用生化分析方法对三龄幼虫的氧化压力进行评价。每组设置3个重复，每个重复50只果蝇幼虫，加入10倍果蝇重量的PBS，在冰上研磨制备幼虫组织匀浆，4 ℃下3500 r/ min离心（半径为7.8 cm）15 min，采用 GSH和 CAT试剂盒测定GSH活力和CAT活力。

1.9 统计学分析

用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。果蝇幼虫的蛹化率、羽化率、CAT 活力、GSH含量和成虫的攀爬能力、羽化后48 h内的死亡率在符合正态分布的情况下用表示，在方差齐的条件下各组间的比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度维生素E对照射后果蝇幼虫蛹化率的影响

由图1可见，在50 Gy γ射线照射后，不同浓度维生素E处理后的果蝇幼虫的蛹化率与单纯照射对照组比较均明显升高，500、1000、1500 mg/L的维生素E组的蛹化率分别从（43.00±2.00）%增加至 （52.66±2.52）%、（67.00±3.61）%和 （71.33±4.04）%，且差异均有统计学意义；而未受照射的果蝇幼虫，随着维生素E浓度的增加，其蛹化率随之降低，差异均有统计学意义。

2.2 不同浓度维生素E对受照后果蝇幼虫羽化率的影响

由图2可见，随着维生素E浓度的增加，果蝇幼虫在50 Gy γ射线照射后的羽化率与单纯照射的对照组比较明显增加，分别从（38.36±1.48）%增加至（44.33±2.08）%、（50.00±4.00）%、（62.67±2.08）%、（63.33±3.06）%，且差异均有统计学意义。

图1 不同浓度维生素E对γ射线照射后果蝇幼虫蛹化率的影响 图中，#：与0 Gy对照组比较，差异有统计学意义（t=3.250、6.325、4.427、4.690，均 P＜0.05）；*：与 50 Gy 单纯照射对照组比较，差异有统计学意义（t=5.209，P=0.006；t=10.082，P=0.001；t=10.883，P=0.000）。对照组为10%蔗糖溶液。Fig.1 Effect of different concentrations of vitamin E on pupation rate of gamma-ray irradiation on drosophila melanogaster larvae

图2 不同浓度维生素E对γ射线照射后果蝇幼虫羽化率的影响 图中，#：与0 Gy对照组比较，差异有统计学意义（t=2.942，P=0.042）；*：与50 Gy单纯照射的对照组比较，差异均有统计学意义（t=4.402，P=0.016；t=4.723，P=0.009；t=16.462，P=0.000；t=12.732，P=0.000）。对照组为10%蔗糖溶液。Fig.2 Effects of different concentrations of vitamin E on the eclosion rate of drosophila melanogaster larvae after gamma irradiation

2.3 不同浓度维生素E对受照后果蝇幼虫48h死亡率的影响

由图3可见，在50 Gy γ射线照射后，与未照射对照组比较，1000 mg/L和1500 mg/L维生素E组的果蝇幼虫羽化为成虫48 h内的死亡率分别从（54.0±5.0）% 降低至（36.1±7.6）% 和（37.5±5.8）%，且差异均有统计学意义。

2.4 不同浓度维生素E对受照果蝇幼虫攀爬能力的影响

由图4可见，与单纯照射对照组比较，1000 mg/L和 1500 mg/L维生素 E组果蝇幼虫受照后攀爬能力百分比从（24.33±1.52）%升高至（30.00±2.00）% 和（30.67±3.51）%，差异均有统计学意义。

图3 不同浓度维生素E对γ射线照射后果蝇幼虫48 h死亡率的影响 图中，*：与50 Gy单纯照射的对照组比较，差异有统计学意义（t=3.386，P=0.028；t=3.718，P=0.021）。对照组为10%蔗糖溶液。Fig.3 Effects of different concentrations of vitamin E on mortality of drosophila melanogaster larvae at 48 h after gamma irradiation

图4 不同浓度维生素E对γ射线照射后果蝇幼虫攀爬能力的影响 图中，*：与50 Gy单纯照射的对照组比较，差异有统计学意义（t=3.900，P=0.018；t=2.864，P=0.046）。对照组为10%蔗糖溶液。Fig.4 Effects of different concentrations of vitamin E on climbing ability of fruit fly larvae after gamma-ray irradiation at different doses

2.5 不同浓度维生素E对受照果蝇幼虫GSH含量的影响

由图5可见，维生素E浓度分别为500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L处理的果蝇幼虫在γ射线照射后GSH含量与单纯照射的对照组比较有明显增加，从（47.43±2.06）μmoL /mg 增加至（57.00±2.70）、（62.8±1.71）、（62.6±2.31）μmoL /mg，差异均有统计学意义。这说明维生素E可影响受到照射的果蝇幼虫GSH含量。

2.6 不同浓度维生素E对受照果蝇幼虫CAT活力的影响

由图6可见，随着维生素E浓度从100 mg/L至1500 mg/L的增加，γ射线照射后CAT活力与单纯照射对照组比较明显增加，从（39.70±0.95）U/mg升高至（344.7±1.00）、（47.33±2.72）、（54.43±2.90）、（51.00±3.25）U/mg，且差异均有统计学意义。这说明果蝇幼虫在受到照射后维生素E可使CAT的含量升高。

3 讨论

图5 不同浓度维生素E对γ射线照射的果蝇幼虫谷胱甘肽含量的影响 图中，*：与50 Gy照射的对照组比较，差异均有 统 计 学 意 义 （ t=4.911，P=0.008；t=9.955，P=0.001；t=8.611，P=0.001）。对照组为10%蔗糖溶液。Fig.5 Effects of different concentrations of vitamin E on glutathione content in gamma-ray larvae irradiated with different doses of radiation

图6 不同浓度维生素E对γ射线照射的果蝇幼虫过氧化氢酶活力的影响 图中 *：与50 Gy照射的对照组比较，差异均有统计学意义（t=6.303，P=0.003；t=4.913，P=0.008；t=8.357，P=0.001；t=5.820；P=0.004）。对照组为10%蔗糖溶液。Fig.6 Effects of different concentrations of vitamin E on catalase activity of fly larvae exposed to gamma rays at different doses

近年来，随着放射治疗为基础的临床诊断和癌症放疗的增多，辐射对人体的有害程度也有所增加。电离辐射在本质上是有害的，会造成间接的DNA损伤。目前，辐射源广泛应用于治疗、诊断、能源、战争中。核恐怖主义、在外层空间或空中旅行等活动中，利用药物提高辐射抗性，是保护正常组织不受电离辐射的有害影响的一种方法，特别是那些可以作为自由基清除剂和抗氧化剂的天然来源的化合物，能够减少或减轻电离辐射带来的有害影响[7]。

辐射防护剂是一种化合物，具有减少辐射对正常组织的影响，可以降低因电离辐射导致疾病的发病率和病死率。其在临床放射治疗中也有实际用途，因为正常组织应受到保护，防止辐射损伤，大量化合物在体外实验中表现出良好的放射防护作用，但由于急性毒性和不良反应，大部分化合物不适合在体内应用[3]。化学物质可以通过清除生物体内的自由基从而减少DNA链断裂的形成。其可以通过与自由基的反应来阻止自由基的形成或破坏自由基，从而抑制自由基与生物体内分子的反应和辐射暴露时间[8]。真核生物具有减少氧化损伤的抗氧化系统，如限制自由基产生的酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶）。这些物质的存在对真核生物的辐射防护具有重要意义[9]。除了酶以外，真核生物还可以通过饮食补充抗氧化剂来防止自由基的破坏，包括维生素A、维生素C、维生素E、多酚、花青素、黄酮类化合物和异硫氰酸酯等，水果、蔬菜和饮料中的化学物质可以通过不同的机制提供细胞的抗氧化活性[10]。有研究结果表明，维生素E在提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤和癌症、预防心血管疾病等领域均具有显著的作用[11]。

有研究结果发现，高剂量的X射线导致果蝇的蛹化率和羽化率降低，从而抑制果蝇的发育[12]，果蝇生殖细胞暴露于X射线和γ射线会诱导致死突变，同时也会干扰活性氧（ROS）的稳态，导致活性氧的过度产生，从而导致DNA损伤[13]。本研究结果发现，果蝇幼虫在受到照射后蛹化率和羽化率、攀爬能力均降低，羽化后48 h的死亡率升高，体内GSH含量和CAT活力减少，与之前的研究结果相符[12-14]。这表明γ射线辐照诱发的自由基氧化损伤机制可能是通过降低果蝇体内抗氧化酶活力和非酶组分等增加了活性氧和脂质过氧化物的生成，使氧化损伤不断加剧，从而影响果蝇抵抗氧化损伤的能力，造成果蝇蛹化率和羽化率的下降、死亡率的上升。对于未受到照射的果蝇，维生素E组与对照组的GSH含量和CAT活力相比较没有显著的变化，造成此现象的原因可能是本研究选取的实验对象与其他文献报道的不同，其次因为果蝇在不同的生长发育时期各种蛋白的表达可能具有时空性，故其潜在的机制还需进一步的研究。本研究结果表明，维生素E预处理可以缓解高剂量辐射对果蝇造成的氧化应激和DNA损伤，提高受照后果蝇幼虫的蛹化率和羽化率，维生素E通过减轻氧化应激从而改善果蝇的抗辐射能力，验证了维生素E具有辐射防护作用。本研究为辐射防护剂的研发提供了参考。