艾司唑仑联合黄连阿胶汤加减对脑卒中后失眠血亏阴虚证大鼠的影响

张红艳， 池发斌， 张 宁， 许素燕， 王爱凤∗

（1.阜外华中心血管病医院河南省人民医院心脏中心药学部，河南郑州450000；2.河南省人民医院药学部，河南 郑州450003）

1 材料

1.1 动物 SPF 级健康雄性Wistar 大鼠75 只，体质量（210±20） g，由河南中医药大学科研实验动物中心提供，实验动物生产证号SYXK（豫）2012-00009，分笼饲养。实验前3 d 适应环境，自由饮水，自然光照，室温 （20±2）℃。

1.2 试药 黄连阿胶汤加减由免煎中药颗粒生地、当归各20 g，黄连、黄芩各12 g，黄芪、阿胶各9 g，白芍6 g（江阴天江药业有限公司） 组成。艾司唑仑片（四川大冢制药有限公司，批号H20170205）。5-HT、5-HIAA 酶联免疫试剂盒购自上海赛默生物科技发展有限公司；NA、DA 酶联免疫试剂盒购自美国R＆D 公司；PBS 缓冲液、DAB 显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；RIPA 裂解液、PMSF、蛋白上样缓冲液购自兰州晟威生物科技有限公司。1.3 仪器 BS110S 型电子天平购自德国赛多利斯公司；XJ80-2 型医用离心机购自金坛市恒丰仪器厂；ND-97 型数字化脑电图仪购自上海医疗器械高技术公司；56100 型大鼠脑立体定位仪购自美国Stoelting 公司；TSJ-II 型全自动封闭式组织脱水机购自常州市中威电子仪器有限公司；7230G 型分光光度计购自上海精密仪器仪表有限公司；MT-360 型液体快速混合器购自常州德杜精密仪器有限公司；043BR38725 型电泳仪购自新加坡ESCO 公司；1305529 型转膜仪、1124003 型凝胶拍照仪购自北京赛百奥科技有限公司；PVDF 膜，购自兰州晟威生物科技有限公司；HH-702 型超级恒温水浴锅购自北京晨曦勇创科技有限公司。手术器械、缝合针由河南中医药大学科研实验中心提供。

2方法

2.1 造模

2.1.1 脑卒中模型 参照Koizumi［5］报道的方法建立，并加以改良。大鼠仰卧位固定，颈部备皮，消毒，注射3%戊巴比妥钠（45 mg／kg） 麻醉，颈部正中切口，逐层分离组织以充分暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，同时分离迷走神经以免误伤而出现呼吸骤停，结扎颈总动脉近心端及颈外动脉根部，备线打一活结，动脉夹夹闭远心端，于分叉处下方剪一斜行切口，将备好的渔线从切口处插入，轻轻旋转，由切口处进入约（18.5±0.5） mm，有阻力感时停止推进，此时已阻断了大脑中动脉入口，然后立即备线结扎，固定线栓以防止出血，撤去动脉夹，缝合伤口，消毒，渔线暴露在皮肤之外，2 h 后拔出渔线；空白组渔线插入仅10 mm，其余步骤同上。再灌注48 h 后将大鼠处死，留取标本待测，造模后24 h 参照Zea Longa［6］报道的方法进行神经系统功能评分。

2.1.2 失眠血亏阴虚证模型 在脑卒中模型基础上参照游秋云等［7］报道的方法建立。 大鼠腹腔注射环磷酰胺（100 mg／kg） 制备血亏模型，同时腹腔注射氢化可的松（50 mg／kg） 制备阴虚证模型。

2.2 分组与给药 75 只大鼠按体质量随机分为空白组、模型组、联合组［艾司唑仑（2 mg／kg） +黄连阿胶汤加减（18.0 g／kg） ］、艾司唑仑组（2 mg／kg）、黄连阿胶汤加减组（18.0 g／kg），每组15 只，剔除死亡和不符合纳入标准者，每组随机取10 只。给药组大鼠按5 mL／kg 剂量灌胃给药，空白组、模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，1 次／d，连续14 d。

2.3 指标检测

2.3.1 睡眠时相［8］大鼠觉醒-睡眠周期包括Wake 期、SWS1 期、SWS2 期、REMS 期，TST=SWS1 期+SWS2 期+REMS 期。规定每一个独立的睡眠时相持续时间＞20 s，并将20 s 作为一个睡眠时相的分析单元。

本研究的结果可以为海洋溢油的微生物修复提供优良菌源和基础数据。但论文中很多的研究工作还处于初始阶段，未来应进一步深化研究。

2.3.2 脑干和下丘脑中GAD、GS 蛋白表达［9］采用免疫印迹进行测定。

2.3.2.1 样本制备 脱颈椎处死大鼠，取脑组织，称定质量后剪碎，加入RIPA 裂解液和PMSF，匀浆、超声（消耗功率160 W，加热功率260 W，频率59 kHz）15 min，4 ℃离心（12 000 r／min）10 min，取上清液，作为总蛋白。双光束紫外可见分光光度计进行蛋白定量（严格按照仪器操作说明），加入蛋白上样缓冲液。

2.3.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 10%丙烯酰胺配置分离胶后，移至两层玻璃板之间进行胶凝，3.9%丙烯酰胺配置浓缩胶，灌注，封口，胶凝，胶板置于电泳槽中，倒入电泳缓冲液，加入样品和Maker，当目标条带跑到分离胶底部时停止电泳，取胶。

2.3.2.3 转膜 依据凝胶大小剪下滤纸和PVDF 膜，按顺序放好滤纸、PVDF 膜、凝胶，连接电极，100 V 下转移1 h。

2.3.2.4 封闭 转膜后取PVDF 膜，置于封闭液中封闭3 h，然后放入一抗、二抗，室温下分别孵育2 h。

2.3.2.5 显色 在膜上滴显色AB 液，即刻放到凝胶成像系统拍照。

2.3.3 下丘脑中神经递质水平［10］取大鼠全脑组织，冰冷生理盐水除去脑膜血管，冰冷平皿中分离下丘脑，称定质量，加入正丁醇，在玻璃匀浆器中匀浆，离心（3 000 r／min）5 min，吸取上清液2 mL，加入pH 6.5 磷酸盐缓冲液，摇匀，与氧化碘试剂行反应，测定下丘脑中5-HT、NA、5-HIAA、DA 吸光度，绘制标准曲线，换算成其水平。

2.3.4 血浆中神经递质水平 处死大鼠后取腹主动脉血5 mL，加肝素抗凝，离心（3 000 r／min） 10 min，严格按照酶联免疫试剂盒操作测定血浆中5-HT、NA、5-HIAA、DA 水平。

2.4 统计学分析 通过SPSS16.0 软件进行处理，计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析，2 组间比较采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对大鼠睡眠时相的影响 表1 显示，与空白组比较，模型组SWS1、SWS2、REMS、TST 显著缩短（P＜0.05）；与模 型 组 比 较， 联 合 组、 艾 司 唑 仑 组SWS1、 SWS2、REMS、TST 显著延长 （P ＜0.05），黄连阿胶汤加减组SWS2、REMS 显著延长（P＜0.05）。

表1 对大鼠睡眠时相的影响

表1 对大鼠睡眠时相的影响

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 剂量／（g·kg-1） Wake／sSWS1／sSWS2／s REMS／s TST／s空模联艾黄白型合司连组组组唑阿 仑胶 组汤 加 减组0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 333 3318236 81071.....84846 26367±±±±±24333 93692.....36444 59267 ∗## 111 18109 83681.....15225 53158±±±±±21222 86533.....52685 67532 ∗## 31322 52597.....31744 45583±±±±±85876.....57182 12926 ∗### 10 4877.....23981 68643±±±±±42323.....60711 24256 ∗### 11111 60654 30068.....70941 55254±±±±±42333 14712.....60579 93614∗##

3.2 对GAD、GS 蛋白表达的影响 图1、表2 显示，与空白组比较，模型组GAD 蛋白表达显著降低（P＜0.05），GS 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，联合组、艾司唑仑组、黄连阿胶汤加减组前者蛋白表达（除黄连阿胶汤加减组下丘脑外） 显著升高（P＜0.05），后者蛋白表达显著降低（P＜0.05）。

3.3 对大鼠下丘脑中神经递质的影响 表3 显示，与空白组比较，模型组5-HT、5-HIAA 水平显著降低（P＜0.05），NA、DA 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，联合组、艾司唑仑组、黄连阿胶汤加减组前两者水平显著升高（P＜0.05），后两者水平（除艾司唑仑组DA 外） 显著降低（P＜0.05）。

3.4 对大鼠血浆中神经递质的影响 表4 显示，与空白组比较，模型组5-HT、5-HIAA 水平显著降低（P ＜0.05），NA、DA 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，联合组、艾司唑仑组、黄连阿胶汤加减组前两者水平（除黄连阿胶汤加减组5-HT 水平、艾司唑仑组5-HIAA 水平外） 显著升高（P＜0.05），后两者水平（除艾司唑仑组DA 外）显著降低（P＜0.05）。

图1 各组GAD、GS 蛋白表达

表2 对GAD、GS 蛋白表达的影响

表2 对GAD、GS 蛋白表达的影响

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 剂量／（g·kg-1）脑干GAD下丘脑 脑干GS下丘脑空模联艾黄白型合司连组组组唑阿 仑胶 组汤 加 减组0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 00000.....64665 71605 25146 62322±±±±±00000.....00000 85467 62222 21769 ∗### 00000.....75765 26077 33815 44462±±±±±00000.....00000 74367 23522 47186 ∗## 00000.....56666 98123 52506 38224±±±±±00000.....01000 72687 58229 61868 ∗### 00000.....46556 59672 99231 28699±±±±±00000.....00000 69667 25233 93914∗###

表3 对大鼠下丘脑中神经递质的影响

表3 对大鼠下丘脑中神经递质的影响

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 剂量／（g·kg-1） 5-HT／（μg·g-1） NA／（μg·g-1） 5-HIAA／（μg·g-1） DA／（μg·g-1）空模联艾黄白型合司连组组组唑阿 仑胶 组汤 加 减组0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 10100.....15088 84221 59643 94418±±±±±00000.....00000 96886 52564 79129 ∗### 01111.....95012 56751 32293 78626±±±±±00000.....01001 92991 55250 69439 ∗### 00000.....42433 51178 07653 23317±±±±±00000.....00000 73675 26211 91766 ∗### 12111.....50696 16214 94355 19234±±±±±00000.....11111 15245 43510 84476∗##

表4 对血浆中神经递质的影响

表4 对血浆中神经递质的影响

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 剂量／（g·kg-1） 5-HT／（μg·L-1） NA／（μg·L-1） 5-HIAA／（μg·L-1） DA／（μg·L-1）空模联艾黄白型合司连组组组唑阿 仑胶 组汤 加 减组0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 331 3185258.....42585 28223±±±±±76776.....22603 64169 ∗## 1 30345 62733 24219.....98728 23192±±±±±24333 92147.....23262 67911 ∗### 111 76574.....52217 39762±±±±±32332.....14109 63862 ∗## 25343 34193.....51528 26257±±±±±79789.....16427 91242∗##

4 讨论

失眠属中医“不寐”“不瞑” “不得卧” 等范畴［11］，认为脑卒中后神经支配功能受损，脉络痹阻，气血运行不畅，日久化火伤阴，耗伤阴液，阳不交阴，气机逆乱，上犯于脑，而脑为人体元神之府，元神惊扰时心神失养，导致失眠［12］。黄连阿胶汤源自《伤寒论》，由黄连、黄芩、白芍、鸡子黄、阿胶组成，用于心肾不足、阴虚火旺较重的心烦失眠，方中黄连泻心火除烦，配伍黄芩则清火力大；阿胶益肾水，佐芍药则益水力强；去鸡子黄加生地滋阴降火，养血生津，阴生火降而神有所藏，而加当归补血活血，滋阴润燥，血足血行而神有所属；阿胶滋阴补血，滋肾阴以养气血，为润燥良品，加少许黄芪补气升阳， “养静”之阴药中加入“走动” 之阳药，行而不滞，阳中求阴，共奏滋阴养血、宁心安神之效。

5-HT 又称血清素，是广泛存在于哺乳动物组织细胞中的抑制性单胺类神经递质，作为可产生愉悦情绪的信使，它几乎影响到大脑皮层感受的每一向功能，从调节心情、判断力、记忆力到塑造人生观，主要分布于下丘脑与松果体，可参与痛感、睡眠等生理活动的调节［13］，中枢神经系统中其水平降低可导致偏头痛、失眠、抑郁等多种疾病发生，在外源性刺激作用下5-HT 释放、分布到血液中，主要被血小板摄取、储存，储存量占机体8%左右；5-HIAA 是5-HT 代谢最终产物，在中枢神经系统调节中具有重要作用［14］，精神病、脑功能障碍、睡眠障碍、苯酮尿症患者其水平减少；NA 是一种维持生命活动的重要神经递质，脑组织中它主要来自交感节后神经元与脑内肾上腺素能神经末梢，循环血液中的主要由其肾上腺髓质合成和分泌［15］，可收缩血管，导致血压上升，增加冠状动脉血流量，同时可增强心肌收缩力，导致血供减少，缺血加重，扩大梗死范围；DA 是由脑组织分泌的一种神经传导递质，负责大脑皮层感觉、情绪信息传递，它作用于脑组织神经系统，可提高记忆力，在睡眠和觉醒中发挥重要作用［16］，其水平降低会导致控制肌肉能力下降，直接影响人们情绪。本实验发现，艾司唑仑联合黄连阿胶汤加减可有效改善脑卒中后失眠血亏阴证大鼠睡眠状况，其作用机制可能为升高下丘脑和血浆中5-HT、5-HIAA 水平，降低NA、DA 水平，从而改善脑部组织微循环，修复受损神经功能，松弛肌肉，扩张血管，增加脑组织供血供氧量，调节心情。