人参皂苷Rg1 对糖尿病大鼠勃起功能障碍的影响

夏雨果， 陈 秋， 高 坪， 曾文彤， 张 闯， 胡臣玲

（1.成都中医药大学临床医学院／附属医院泌尿外科，四川 成都610072；2. 成都中医药大学附属医院内分泌科，四川 成都610072）

勃起功能障碍是糖尿病常见的并发症［1］，是影响患者生活质量及家庭和谐的重要因素，其发病机制不明，缺乏有效的预防及治疗措施。中医对勃起功能障碍有独特疗效，本实验研究人参皂苷Rg1对糖尿病大鼠勃起功能障碍的影响，并探讨其作用机制，为患者治疗提供新思路。

1 材料

清洁级雄性SD 大鼠，约6 ～7 周龄，体质量200～350 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验经成都中医药大学附属医院伦理委员会批准。人参皂苷Rg1（成都普瑞法科技开发有限公司）；西地那非片 （美国辉瑞公司）；Trizol （美国Invitrogen 公司）； 链脲佐菌素 （STZ）、 阿扑吗啡（APO）、焦碳酸二乙酯（DEPC） （美国Sigma 公司），PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq II Kit［宝生物工程（大连） 有限公司］；实时荧光定量仪（美国Thermo Fisher 公司），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。大鼠一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛（MDA）ELISA 试剂盒（上海茁彩生物科技有限公司）；SIRT1、eNOS；β-actin 抗体（美国Affinity 公司）；浓缩型DAB 试剂盒、羊抗兔二抗（北京中衫金桥生物有限公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；蛋白Marker（美国NEB 公司）；ECL 发光试剂盒（美国Thermo公司）；聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜（美国Hybond公司）；大鼠ICP／MAP 测定采用BL-420 生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；免疫组化采图及分析采用Image-Pro Plus 6.0（美国Media Cybernetics 公司）。

2 方法

2.1 模型建立 90 只大鼠在SPF 环境下适应性饲养1 周后测定随机血糖，作为基线，随机选取10只作为正常组，其余80 只作为实验组。实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱导1 型糖尿病，剂量60 mg／kg；正常组大鼠腹腔注射等量生理盐水以减少实验误差，注射后7 d 取尾静脉血测定随机血糖，以其＞16.7 mmol／L 作为成模标准［2］，未成模者补充注射1 次链脲佐菌素，剂量30 mg／kg，注射后3 d再按以上标准筛选模型。糖尿病大鼠饲养10 周后，参照Heaton［3］报道的方法筛选，将阿扑吗啡按100 μg／kg 剂量皮下注射于大鼠颈部皮肤，观察30 min，记录有无勃起及勃起次数，未勃起者为勃起功能障碍，勃起标准为龟头露出充血，包皮后退，阴茎膨大增长。

2.2 分组及给药 注射链脲佐菌素后4 只大鼠无法诱导成糖尿病，同时糖尿病大鼠喂养期间死亡7只，最终筛选出56 只。原有正常组不变，将筛选成功的大鼠随机分为4 组，每组14 只，分别为正常组、模型组（灌胃等量生理盐水）、人参皂苷Rg1低剂量组（灌胃15 mg／kg） 和高剂量组（灌胃30 mg／kg）、西地那非组（灌胃5 mg／kg）。给药2、4 周， 测定大鼠体质量及血糖，4 周后测定ICP／MAP 以评估勃起功能，完成后取大鼠阴茎组织，进行病理学及分子生物学检测。

2.3 阴茎海绵体内压 （ICP） 及平均颈动脉压（MAP） 测定 各实验组大鼠给药4 周后测定ICP／MAP，测定前24 h 停止给药，测定当天早上禁食，予以10%水合氯醛（3 mL／kg） 麻醉，常规消毒铺巾，暴露颈总动脉，将22 号蝶形插管插入颈总动脉并固定与生物机能实验系统以测定MAP 值；解剖分离阴茎，将24 号蝶形针插入阴茎海绵体连接传感器以测定ICP，再分离出阴茎根部海绵体神经，将生物机能实验系统的电极钩住海绵体神经以刺激阴茎勃起，分别测定基础、勃起状态下最高ICP 值。

2.4 MDA、NO、SOD 水平检测 采用ELISA 法。大鼠阴茎组织充分匀浆后， 3 000 r／min 离心15 min，收集上清液，将MDA、NO、SOD 抗体包被于48 孔微孔中制成固相载体，加入对照品或样品。MDA、NO、SOD 连接于固相载体上的抗体结合，彻底洗涤后加入相应抗体，将未结合的生物素抗体洗净后，加入辣根过氧化物酶（HRP） 标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入四甲基联苯胺底物显色，它在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色，颜色深浅与3 种因子水平呈正相关。然后，在450 nm 波长下检测吸光度（OD 值），计算样品浓度。

2.5 mRNA 表达检测 采用qPCR 法。将液氮中保存的阴茎组织按说明书用Trizol 提取总RNA 后，依次加入DNA Eraser Buffer、DNA Eraser、RNase Free dH2O，42 ℃下反应2 min 以去除基因组DNA，将所得RNA 用PrimeScript RT Enzyme Mix I 试剂盒进行逆转录反应，反应完成后加入引物进行PCR扩增， 引 物 序 列 为β-actin （正 向5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′，反向5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA） -3′、SIRT1（正向5′-TGGCAGTAACAGTGACAGTGGCACAT-3′， 反 向 5′-TCAGCTCCAGATCCTCCAGCACACTC-3′）， eNOS （正 向5′-AGCTGGATGAAGCCGGTGAC-3′，反向5′-CCTCGTGGTAGCGTTGCTGA-3′）。反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃充分延伸并采集荧光30 s，以上反应循环40 次，结果采用2-ΔΔCt法进行分析。

2.6 蛋白表达检测 采用Western blot 法。取液氮冻存大鼠睾丸组织100 mg，于37 ℃水浴中解冻后按1 ∶10 的比例加入RIPA 裂解液，灭菌后的小剪刀剪碎，碎冰上裂解10 min，收集裂解液并离心，上清液用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将积层胶配制好并加入电泳液，根据所测蛋白浓度加入60 μg 蛋白量至样孔中进行电泳，电泳结束后按转膜方法覆盖PVDF 膜，接通电源调整至电流至200 mA 转膜1 ～2 h，然后依次封闭，一抗孵育过液，其中一抗浓度按eNOS 1 ∶1 000、SIRT1 1 ∶500、β-actin 1 ∶5 000 的比例进行稀释，再进行二抗孵育，最后进行显影、定影、拍照。Quentity One 进行目的条带分析，目的蛋白相对表达量=目的蛋白积分光密度值（IOD） ／内参积分光密度值（IOD）。

2.7 eNOS 阳性细胞表达检测 采用免疫组化法。将大鼠阴茎病理切片脱蜡后浸入3%甲醇双氧水中10 min，PBS 洗涤3 次，每次5 min，柠檬酸盐缓冲液加温至沸腾， PBS 洗净后加入封闭液浸泡20 min，再加入一抗反应过夜，滴加生物素二抗，37 ℃下反应30 min，PBS 洗涤3 次后DAB 显色，透明树胶封片，光镜下采图，通过Image-Pro Plus 6.0 软件进行分析。

2.8 统计学分析 通过SPSS17.0 软件进行处理，数据用（） 表示，2 组间比较采用t 检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠体质量与血糖 表1 显示，建模1 周后各组大鼠体质量无显著差异（P＞0.05），同时也排除了基线误差；随着生长周期的延长，体质量逐渐增加，但正常组更明显，而在同一时间点实验组体质量均显著低于正常组（P＜0.01），但组间无显著差异（P＞0.05）。表2 显示，注射链脲佐菌素后1周实验组大鼠血糖显著高于正常组（P＜0.01），达到糖尿病诊断标准，同时使用人参皂苷Rg1或西地那非后大鼠血糖值均无显著变化（P＞0.05）。

表1 各组大鼠体质量比较Tab.1 Comparison of rat body weights among various groups

表1 各组大鼠体质量比较Tab.1 Comparison of rat body weights among various groups

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01

组别 动物数／只 造模1 周 造模4 周 造模10 周 给药2 周 给药4 周正模人人西常型参参地组组皂皂那 苷苷非 组RR gg 11低高剂剂量量组组 11111 04444 22222 34444 95122.....62270 17534±±±±±59565.....36418 16275 32222 95586 05136.....31560 35610±±±±±33354 03765.....75156 86251 ∗∗∗∗∗∗∗∗ 43332 70009 87317.....38782 98561±±±±±38545 90334.....15169 33126 ∗∗∗∗∗∗∗∗43222 90878 28241.....96362 43189±±±±±49444 30354.....70855 05938 ∗∗∗∗∗∗∗∗ 53332 13019 02464.....77983 21492±±±±±48344 10829.....60510 17957∗∗∗∗∗∗∗∗

表2 各组大鼠血糖比较Tab.2 Comparison of rat blood glucose among various groups

表2 各组大鼠血糖比较Tab.2 Comparison of rat blood glucose among various groups

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01

组别 动物数／只 造模1 周 造模4 周 造模10 周 给药2 周 给药4 周正模人人西常型参参地组组皂皂那 苷苷非 组RR gg 11低高剂剂量量组组 11111 04444 1211 68087.....36235 72374±±±±±05555.....31839 23304 ∗∗∗∗∗∗∗∗3323 62191.....57275 97901±±±±±03444.....37341 23140 ∗∗∗∗∗∗∗∗ 2232 56509.....45107 25135±±±±±08856.....34432 01702 ∗∗∗∗∗∗∗∗ 2232 58709.....62134 60566±±±±±07825.....44878 06383 ∗∗∗∗∗∗∗∗ 2322 58066.....74169 63504±±±±±07287.....56808 70898∗∗∗∗∗∗∗∗

3.2 SOD、MDA、NO 水平 表3 显示，与正常组比较， 模型组大鼠SOD、 NO 水平显著降低（P＜0.01），MDA 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，人参皂苷Rg1高剂量组SOD、NO水平显著升高（P ＜0.05），MDA 水平显著降低（P＜0.05）。

表3 各组SOD、MDA、NO 水平比较Tab.3 Comparison of SOD，MDA and NO levels among various groups

表3 各组SOD、MDA、NO 水平比较Tab.3 Comparison of SOD，MDA and NO levels among various groups

注：与正常组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01，；与模型组比较，△P＜0.05

组别 动物数／只 SOD／（ng·mL-1） MDA／（nmol·mL-1） NO／（μmol·mL-1）正模人人西常型参参地组组皂皂那 苷苷非 组RRgg 11 低 高剂剂量量组组 11111 04444 22222.....40130 77349 42666±±±±±00000.....11211 74191 56666 ∗∗△∗∗∗∗ 11111.....57656 13266 44020±±±±±00000.....01101 50284 35502 ∗△∗∗96677.....34979 91752 00268±±±±±01100.....42098 98783 19872∗∗∗∗∗∗△△

3.3 ICP／MAP 表4 显示，与正常组比较，模型组ICP／MAP 显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，人参皂苷Rg1组ICP／MAP 显著升高 （P ＜0.05，P＜0.01），以高剂量组更明显。

表4 各组ICP／MAP 比较（，1 mmHg=0.133 kPa）Tab.4 Comparison of ICP／MAP among various groups（，1 mmHg=0.133 kPa）

表4 各组ICP／MAP 比较（，1 mmHg=0.133 kPa）Tab.4 Comparison of ICP／MAP among various groups（，1 mmHg=0.133 kPa）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 动物数／只 MAP／mmHg 勃起前ICP／mmHg 勃起后ICP／mmHg （ICP／MAP）／%正模人人西常型参参地组组皂皂那 苷苷非 组RRgg 11 低高剂剂量量组组 11111 04444 11111 22222 41244.....39933 6880±±±± ±8 423.6...5.56578 738 9 21111 81123.....85920 2660±±±± ±3 322.3...7.29666 6568∗∗ ∗∗∗∗∗∗ 10 3466 65855.....44237 222±±±±±87 126..3..17.7611 685∗∗∗∗ ∗∗∗∗△△ △△△ 82355 59922.....30147 57978±±±±±72544.....87086 02927∗∗∗∗∗∗∗∗△△△△ △

3.4 SIRT1、eNOS mRNA 表达 图1 显示，与正常组比较，模型组SIRT1、eNOS mRNA 表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，人参皂苷Rg1高剂量组两者mRNA 表达显著升高（P＜0.05）。

图1 各组SIRT1、eNOS mRNA 表达Fig.1 mRNA expressions of SIRT1 and eNOS in various groups

3.5 SIRT1、eNOS 蛋白表达 图2 显示，与正常组比较，模型组SIRT1、eNOS 蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，人参皂苷Rg1高剂量组两者蛋白显著升高，其表达量显著高于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。

图2 各组SIRT1、eNOS 蛋白表达Fig.2 Protein expressions of SIRT1 and eNOS in various groups

3.6 eNOS 分布 图3 显示，eNOS 阳性细胞主要分布于血管周围内皮细胞，位于细胞浆；与正常组比较，模型组eNOS 平均光密度值显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，人参皂苷Rg1高剂量组其平均光密度值显著升高（P＜0.05）。

4 讨论

勃起功能障碍是指多种原因造成的阴茎海绵体血液充盈不足，导致阴茎持续不能达到或维持足够勃起以完成并维持满意的性交，是影响众多男性健康和家庭幸福的常见疾病。随着生活水平及方式的改变，糖尿病发病率逐年升高，并且发病年龄呈年轻化趋势， 也成为勃起功能障碍重要原因之一［4-5］，其发病机制可能与糖尿病患者在长期高血糖环境下引起的氧化应激损伤有关，氧化应激所产生的ROS、MDA、8-OHdG 等氧化应激产物损伤血管内皮细胞，影响内皮细胞释放NO 等因子，甚至引起血管内皮细胞凋亡，患者阴茎血管病变导致血管壁弹性纤维的糖基化反应，使海绵体窦状血管舒张能力降低，从而影响阴茎勃起功能［6］。目前，治疗糖尿病勃起功能障碍的方法除了控制饮食和血糖外，其余与普通勃起功能障碍类似，主要以经典的PDE5 抑制剂（5 型磷酸二酯酶抑制剂） 为主，如他达那非、西地那非等，此类药物短期疗效较好，但长期疗效不理想，而且其心血管副作用及部分患者忧虑导致接受度不高，故亟需开发有效的天然药物。

图3 各组eNOS 免疫组化分析（IHC×400）Fig.3 Analysis of eNOS immunohistochemistry in various groups（IHC×400）

中医认为，糖尿病属中医“消渴” 范畴，病久引起阳痿［7］，其成因历代均主张为肾虚，由此也形成了以治肾为主的辨治理论［8］，而治肾又以肾气、肾精为着手点，如人参、杜仲、淫羊霍、鹿茸等药材成为常用中药。其中，人参味甘、微苦，性微温，具有益气补中、生津止渴等功效，被用于治疗消渴病，人参皂苷Rg1是其主要有效成分之一，有明显的抗氧化及保护血管内皮细胞功能，可降低氧化应激产物生成，提高机体抗氧化活性，减少糖尿病并发症发生［9］。课题组前期证明，改善阴茎血管内皮细胞功能可保护勃起功能，将携带多效生长因子（PTN） 基因的脂肪干细胞注射进勃起功能障碍大鼠的阴茎海绵体1 周后，即能检测到该基因高表达，勃起功能得到有效恢复［10］； 文献［11］ 报道，人参皂苷Rg1可通过PI3K-Akt 信号通路来促进eNOS mRNA 表达，增加NO 生成，从而达到抗心肌缺血的作用，而且能显著降低糖尿病大鼠血糖，改善血脂代谢紊乱，提高肝脏及外周组织胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗［12］；由于该成分常用剂量为10 ～40 mg／kg［13］，故本实验选择15、30 mg／kg 进行研究，发现其剂量越高，对勃起功能及生化指标的改善程度越明显，虽未对血糖有明显影响，但它可明显减轻氧化应激损伤，保护阴茎血管内皮细胞，促进eNOS 产生，增加血管舒张因子NO 的产生，从而改善糖尿病大鼠勃起功能。

沉默信息调节因子2 相关酶1（Sirt1）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性的去乙酰化酶，广泛存在于机体的各种体细胞及生殖细胞中，具有减缓血管内皮细胞衰老、提高血管内皮细胞功能等作用［14］，可通过调节内皮源型一氧化氮合酶（eNOS）等活性来促进NO 生成，改善内皮依赖的血管舒张活性，并延缓内皮细胞衰老［15-16］，故对以内皮功能障碍为主要病因的疾病，特别是勃起功能障碍，它可能是其潜在的治疗靶点之一。 Yu等［17］发现，白黎芦醇可通过激活Sirt1 基因来改善糖尿病大鼠的勃起功能，其主要机制是上调其下游基因eNOS 表达，使内皮细胞能产生更多NO，舒张阴茎动脉，从而增加血流量；本实验发现，人参皂苷Rg1 也可上调勃起功能障碍大鼠阴茎组织中该因子表达，从而激活其下游基因eNOS 表达。同时，西地那非虽然能提高eNOS、NO 水平，但对SIRT1、SOD 水平的提高程度，以及阴茎组织氧化应激损伤的保护作用不明显，表明它主要通过抑制PDE-5 来增加eNOS、NO 生成。另外，勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体部分肌纤维结构紊乱甚至纤维化，可能也是影响勃起功能的重要因素，这也是今后研究的重点，也需延长给药时间来观察人参皂苷Rg1对阴茎组织的影响，并考察其安全性。

综上所述，人参皂苷Rg1 能有效减轻勃起功能障碍糖尿病大鼠阴茎组织的氧化应激损伤，明显改善勃起功能，其主要作用机制可能是上调Sirt1／eNOS 信号通路，从而保护血管内皮细胞功能。