解磷菌剂对生菜根际土壤微生物数量和酶活性的影响

杜雷　陈钢　王素萍　洪娟　黄翔　张利红　叶莉霞　张贵友　练志诚

摘要：通过盆栽试验研究了在4种不同施磷水平下，施用解磷菌剂对生菜（Lactuca sativa var. ramosa Hort.）各生育期根际土壤微生物数量和酶活性的影响。结果表明，土壤微生物数量和酶活性都随生菜生育期的进行呈规律性变化，在莲座期达到最大值，在采收期有所下降，但整体仍高于幼苗期;同一生育期，随着施磷水平的增加，解磷菌剂对生菜根际土壤细菌、放线菌的数量和各种酶活性的影响逐渐增强，在施磷量（P2O5）为0.060 g/kg时达到最大值，当施磷量达到0.120 g/kg时，解磷菌剂对土壤微生物数量和酶活性无促进作用;解磷菌剂对土壤真菌数量的影响与细菌数量变化规律相反。解磷菌剂配合适量磷肥施用，有利于土壤微生物数量的增加和酶活性的提高，从而为生菜生长创造良好的微生态环境。

关键词：解磷菌剂;根际土壤微生物;酶活性;生菜（Lactuca sativa var. ramosa Hort.）

中图分类号：S636.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）11-0070-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.11.016           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of phosphate-solubilizing bacteria on rhizosphere

microorganism and enzyme activities of lettuce

DU Lei，CHEN Gang，WANG Su-ping，HONG Juan，HUANG Xiang，ZHANG Li-hong，

YE Li-xia，ZHANG Gui-you，LIAN Zhi-cheng

（Institute of Environment and Safety，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430345，China）

Abstract： A potting experiment was conducted to evaluate the effects of the phosphate-solubilizing bacteria on rhizosphere soil microorganism and enzyme activities at different growth stages of lettuce（Lactuca sativa var. ramosa Hort.） under four application levels of calcium-superphosphate. The results showed that the microorganism quantity and enzyme activity were regular change with growth periods of lettuce， they were reached a maximum in the rosette stage and declined in the harvest time， the least was the seedling stage. The effects on rhizosphere bacteria and actinomycetes， and enzyme activities increased progressively with application levels of calcium-superphosphate during the same period， which was the best under 0.060 g/kg application levels of calcium-superphosphate. However， it had no stimulative effect when the application level of calcium-superphosphate was 0.120 g/kg. On the contrary， the number of soil fungi had a reverse rule. So the appropriate phosphate and phosphate-solubilizing bacteria application with the lettuce microorganism quantity and enzyme activity were positive effect， and created a good micro-ecolobical environment for the growth of lettuce.

Key words： phosphate-solubilizing bacteria; rhizosphere soil microorganism; enzyme activity; lettuce（Lactuca sativa var. ramosa Hort.）

中國土壤全磷含量较高，但能被植物直接吸收利用的有效磷含量一般不超过全磷量的5%，大部分磷以难溶的无效态在土壤中积累起来，这不仅耗竭有限的磷矿资源、造成环境污染，还会给食物安全和人类健康带来影响[1，2]。解磷菌是土壤中能将难溶性磷转化为植物能够吸收利用的可溶性磷的一类特殊的微生物功能类群，主要通过分泌各种酶类、有机酸来活化土壤中的难溶态磷，提高土壤有效磷含量，从而促进植物的生长发育[3-5]。解磷菌的应用对改善土壤结构、提高土壤中磷的利用率、改良盐碱地和维持农林业生态平衡等具有极其重要的意义[6]。徐文凤等[7]通过盆栽试验发现1%、2%的溶磷真菌PFK-1与硝基肥复配能增加油菜的鲜重和干重，亦能增加其土壤有效磷含量;何雪香等[8]通过秋茄盆栽接种试验发现，从红树林地区筛选得到的部分解磷菌和固氮菌对秋茄苗高和生物量有明显促进作用;邢芳芳等[9]发现溶磷真菌PSFK具有很强的降解无机磷的能力，且能显著提高鸡毛菜的生物产量和叶片数。目前，对解磷菌的应用研究主要集中在其对作物的产量、品质、生物性状和土壤有效磷含量的影响上，有关其对作物根际土壤微生态环境和土壤酶活性的影响报道较少[10]。

土壤微生物和酶参与土壤生物化学过程，在土壤物质转化、能量代谢、污染物降解及修复等方面起着重要作用[11]，可反映土壤质量的变化，表征土壤中物质代谢的旺盛程度，可作为土壤质量评价的重要指标[12]。解磷菌的解磷能力和促生效应受土壤生态条件的影响，与植物根际土壤微生物群落结构和酶活性密切相关，并受植物生长发育进程的反馈调节[13]。研究其相关因素包括土壤微生物种类和数量、酶活性、土壤本身的物化性质、磷素在土壤中的形态等对解磷效果的影响，有助于明确解磷微生物的解磷机理及特有解磷微生物的使用范围和最优方案，对土壤的可持续发展具有重要意义。本试验研究了在不同施磷水平下，接种解磷菌剂对生菜各生育期根际土壤细菌、真菌、放线菌数量和土壤过氧化氢酶、脲酶、转化酶、碱性磷酸酶活性的影响，探讨了解磷菌剂在土壤不同磷素水平下发挥最大的解磷效果，并进一步阐明了解磷菌剂在生菜（Lactuca sativa var. ramosa Hort.）不同生育期促生效应的微生物学作用机制，旨在为解磷菌剂的生产应用提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料与盆栽试验设计

试验在武汉市农业科学院北部园区玻璃温室内进行。土壤为灰潮土，土壤有机质含量为10.5 g/kg，硝态氮含量为25.23 mg/kg，有效磷含量为9.66 mg/kg，全磷含量为0.72 g/kg，速效钾含量为110.89 mg/kg，pH 7.86。

试验采用盆栽设计，共设6个处理，分别为不施磷+灭活菌剂（CK）、不施磷+解磷菌剂（T1）、施1/4常规用量磷+解磷菌剂（T2）、施1/2常规用量磷+解磷菌剂（T3）、施常规用量磷+解磷菌剂（T4）和施常规用量磷+灭活菌剂（T5）。各处理在等氮、钾养分条件下施肥，每盆装土15 kg，所用化肥为尿素（含N 46%）、过磷酸钙（含P2O5 16%）、硫酸钾（含K2O 51%），尿素、硫酸钾用量各处理分别为0.326、0.098 g/kg，常规磷施用量为过磷酸钙0.750 g/kg（换算为P2O5用量为0.120 g/kg），以上肥料作基肥一次性拌土施入。

所用生菜种子为澳优四季生菜，武汉金正现代种业有限公司生产。所用解磷菌剂为作者实验室筛选的P1菌株液体扩大培养所制成，活菌含量达2.0×1010 CFU/mL以上，其中灭活菌剂即为P1菌株发酵液121 ℃灭菌后所得。解磷菌P1是从武汉市长期种植的蔬菜根际土壤中筛选得到的1株高效解磷菌株，经鉴定该菌株为苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti），目前已將该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2016333。解磷菌剂接种量为每棵50 mL，于生菜移栽后浇灌于根部周围。每处理10盆，每盆种生菜2棵，重复间随机排列，管理一致。

1.2  土壤样品采集及测定指标

在生菜生长过程中的幼苗期、莲座期和采收末期，选取3棵长势均匀的植株将其挖出，抖掉根系外围土，取紧贴在根表附近的土样，混合后作为根际土，用无菌塑料袋装好带回实验室，取部分鲜样用于分析土壤微生物含量;另外部分风干，去杂，过1 mm筛后用于测定土壤酶活性。

1.2.1  土壤微生物数量的测定  采用稀释平板计数法测定土壤中微生物数量。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基;放线菌采用改良高氏I号培养基;真菌采用马丁氏培养基;每处理3次重复，结果以每克干土所含数量表示。

1.2.2  土壤酶活性的测定  过氧化氢酶采用KMnO4滴定法测定，以每克土壤消耗的0.002 mol/L KMnO4的体积表示;脲酶采用苯酚钠比色法测定，以3 h后每百克土中NH4+-N的体积表示;转化酶采用硫代硫酸钠滴定法测定，以24 h后每克土中0.1 mol/L硫代硫酸钠体积表示;碱性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定，以24 h后每克土中酚的质量表示[14]。

1.3  数据分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0软件处理分析，采用最小显著法（LSD）进行差异显著性检验。

2  结果与分析

2.1  解磷菌剂对生菜根际土壤细菌数量的影响

由图1可以看出，各处理的根际土壤细菌数量随着生菜生育期的推进整体呈先上升后下降的趋势，在莲座期细菌数量达到最大值，在采收末期细菌数量有所下降，但整体仍高于幼苗期。在生菜整个生育期中，各处理细菌数量变化不一致。在幼苗期，当磷肥用量为零时，T1处理的细菌数量要显著高于CK，当磷肥用量为最大值时，T4处理的细菌数量也显著高于T5处理，说明幼苗期在施磷量相同的情况下，添加解磷菌剂有利于提高生菜根际土壤细菌数量。在莲座期和采收期，在施磷量相同的情况下，T1处理的细菌数量依然显著高于CK，但T4处理和T5处理的细菌数量无显著差异，说明在莲座期后，高磷水平处理添加解磷菌剂不能增加根际细菌数量，但低磷水平处理添加解磷菌剂依然能显著提高根际细菌数量。在生菜整个生育期中，添加解磷菌剂的各处理随着施磷水平的增加，细菌数量呈先增加后下降趋势，在T3水平达到最大值，T3处理和T2处理的细菌数量呈相同水平，都显著高于其他处理，T4、T5处理较小，都显著低于其他施磷处理，说明解磷菌剂在缺磷情况下能显著提高根际细菌数量，在高磷水平下对根际细菌数量无促进作用。

2.2  解磷菌剂对生菜根际土壤真菌数量的影响

由图2可以看出，各处理的根际土壤真菌数量随着生菜生育期的推进整体也呈先上升后下降的趋势，但在整个生育期不同处理对其根际真菌数量的影响不同。在幼苗期，添加解磷菌剂的各处理根际真菌数量均有所减少，其中T3处理减少幅度最大，T2处理次之，T4和T1处理减少幅度较小，但都与CK和T5处理差异显著。在莲座期和采收期，各处理根际真菌数量变化趋势相似，各添加解磷菌剂的处理中，低磷水平的T1、T2和T3处理间根际真菌数量无显著差异，但都显著低于T4处理;在高磷水平下，T4处理和T5处理根际真菌数量无显著差异，说明高磷水平下施用解磷菌剂对根际真菌数量也无影响。在生菜整个生育期中，CK的根际真菌数量都显著高于其他各处理，这可能与其生长缓慢有关。

2.3  解磷菌剂对生菜根际土壤放线菌数量的影响

由图3可以看出，各处理根际土壤放线菌数量变化趋势与细菌数量变化趋势相似，但不同生育期各处理根际放线菌数量变化不同。在幼苗期，低磷水平下，T1处理的放线菌数量显著高于CK;高磷水平下，T4处理与T5处理无显著差异;各添加解磷菌剂处理间，随着磷水平的增加，放线菌数量也随着增加，在T3水平下达到最大值，显著高于其他处理，当施磷量达到T4水平时，放线菌数量降低，具体为T3>T2>T1>T4。在莲座期，各处理放线菌数量均有所增加，但整体变化规律与幼苗期一致。在采收期，各处理放线菌数量均开始下降，其中T1、T2和T3处理放线菌数量达相同水平，CK、T4和T5处理放线菌数量达相同水平，前者显著高于后者。

2.4  解磷菌剂对生菜根际土壤过氧化氢酶活性的影响

由图4可以看出，各处理根际土壤过氧化氢酶活性随着生菜生育期的推进整体呈微弱的上升趋势，在生菜整个生育期中，各处理根际土壤过氧化氢酶活性变化不大，CK的土壤过氧化氢酶活性显著低于其他各添加解磷菌剂处理;T4处理和T5处理间无显著差异，但都显著低于T3处理。说明在低磷水平下，添加解磷菌剂能显著提高土壤过氧化氢酶活性，但在高磷水平下添加解磷菌剂对土壤过氧化氢酶活性无影响。

2.5  解磷菌剂对生菜根际土壤脲酶活性的影响

土壤脲酶主要来源于植物和微生物，是决定土壤中N转化的关键酶，其活性高低反映了各种生化过程的方向和强度。由图5可以看出，各处理的脲酶活性随着生菜生育期的推进整体呈先上升后下降的趋势，与土壤细菌数量变化规律相似。随着施磷水平的增加，土壤脲酶活性也逐渐增加，在施磷水平为T3处理时，土壤脲酶活性最高，当施磷水平高达T4处理时，土壤脲酶活性反而受到抑制作用。

2.6  解磷菌剂对生菜根际土壤转化酶活性的影响

土壤转化酶是参与土壤有机碳循环的酶，其活性强弱反映了土壤呼吸强度、土壤熟化程度及肥力水平状况。由图6可以看出，各处理的根际土壤转化酶活性随着生菜生育期的推进整体也呈先上升后下降的趋势，不同生育期各处理根际土壤转化酶活性整体变化趋势相似，在莲座期和采收期，不添加解磷菌剂的两个处理CK和T5之间的根际土壤转化酶活性差异较小;添加解磷菌剂的各处理根际土壤转化酶活性随着磷水平的增加而增加，在T3水平达最大值，且各处理间差异显著，当施磷水平为T4时，根际土壤转化酶活性与CK达相同水平，显著低于其他各解磷菌剂处理。

2.7  解磷菌劑对生菜根际土壤碱性磷酸酶活性的影响

土壤磷酸酶是催化土壤中磷酸单酯和磷酸二酯水解的酶，它能将有机磷酯水解为无机磷酸。由图7可以看出，各处理碱性磷酸酶活性随着生菜生育期的推进整体呈先上升后下降的趋势。各处理碱性磷酸酶活性也随施磷水平的增加而逐渐增加，在T3水平达最大值，当施磷水平达T4水平时，土壤碱性磷酸酶活性在一定程度上也受到抑制作用。

3  小结与讨论

根际是一个很特别的微区域，由于植物根系的影响，使其周围的微域在物理、化学和生物特性方面与土体主体不同[15]。已有研究表明不同作物的根际有其特定的微生物群落，即同一作物在不同生育期和营养状态下，其根际微生物数量与酶活性也呈现一定的动态变化[16]。本研究结果表明，各处理根际土壤细菌、真菌和放线菌数量都随着生菜生育期的推进整体呈先上升后下降的趋势，在莲座期达到最大值，在采收期有所下降，但整体仍高于幼苗期;各处理的脲酶活性、转化酶活性和碱性磷酸酶活性与根际土壤微生物数量变化规律相似，随着生菜生育期的推进整体呈先上升后下降的趋势;各处理过氧化氢酶活性变化差异不大，随着生菜生育期的推进整体呈微弱上升趋势。这与前人研究结果一致，根际微生物数量和酶活性与植株生长发育进程具有一定相关性[17]。生菜从幼苗期到莲座期生长迅速，新陈代谢逐渐加强，养分需求量加大，根系分泌物（各种酶类）增多，根系周围区域微生物活动活跃，从而促进土壤养分的分解，以满足植株的生长发育;进入采收末期后，生菜生长减缓，光合作用降低，对养分的需求也逐渐降低，根际各类微生物数量和土壤酶活性也就相应降低。生菜根系分泌物的差异以及对微生物的作用机制还有待进一步研究。

解磷菌剂对根际微生物数量及酶活性的影响与施入的磷水平密切相关。蒋欣梅等[18]在研究解磷微生物对大棚茄子生长中指出，磷素在土壤中存在一个平衡系统，当施加磷肥后未被固定的磷素被植物吸收利用，之后会出现磷亏损，此时会有土壤的化学平衡和土壤微生物对大部分难溶磷的矿化和分解来补充磷素营养，土壤中解磷微生物与土壤有效磷含量之间存在密切相关关系。本试验共设4个施磷水平，结果表明，添加解磷菌剂的各处理随着施磷量的增加，根际细菌、放线菌数量和各种酶活性都呈先上升后下降趋势，在T3水平达到最大值，当施磷水平达T4处理时，根际细菌、放线菌数量和各种酶活性都无促进作用，反而显著低于T3处理;各处理真菌数量变化规律与其相反，T1、T2和T3处理的真菌数量都显著低于T4处理。这与许艳丽等[19]研究一致，施入解磷菌剂后，植株根际细菌和放线菌的数量同真菌数量的比值（B/F、A/F）增大，有效改善了根际土壤的微生态环境，提高了土壤肥力。生菜的生长需要充足的磷素营养，同样土壤中微生物的正常生长也需要一定水平的磷素营养，当土壤有效磷含量低或不施磷时，土壤磷素水平不能满足这一要求，植株生长发育小，土壤微生物繁殖慢;但当土壤有效磷含量过高时，植物根系无需外力帮助就可吸收所需的全部磷素，根系分泌物减少，根际微生物活动受到抑制[20]。因此，要充分发挥解磷菌的有益效应，应适当配合施用磷肥，以保证解磷微生物的正常生长，提高解磷微生物的定殖能力。

土壤微生物和土壤酶既是土壤有机物转化的执行者，又是植物营养元素的活性库。本试验从土壤微生态环境和酶活性方面研究了施用解磷菌剂后对生菜的促生作用，结果表明，解磷菌剂的施用显著改善了生菜根际土壤微生物结构和酶活性，解磷菌剂和化肥配合施用效果更好。通过本试验得出，当P2O5施用量为0.060 g/kg时，解磷菌剂的促生效果最好，磷肥施入量过高或过低都不利于解磷菌剂发挥溶磷效果。施用解磷菌剂在一定程度上减少了化学磷肥的使用量，降低了农业生产成本。如何充分发挥解磷菌剂的溶磷效果，还有待进一步研究。

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