两种稀释剂不同稀释倍数对猪精液保存效果的研究

2019-07-22付永利唐佩娟于海霞李泽清崔茂盛

猪业科学 2019年6期

张丹，付永利，唐佩娟，刘鑫，殷茵，于海霞，李泽清，张颖，李奎，崔茂盛*

（1.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402；2.天津市畜牧总站，天津 300402；3.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；4.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100094）

自从20世纪80年代猪人工授精广泛应用以来，现阶段实际输精操作中90%以上采用恒温保存精液，有研究表明，精液稀释倍数对精液的长期保存具有明显的影响，稀释比例较小，精子密度较大，随着精子不断代谢导致营养物质无法满足精子的长期存活；除此以外，高密度精子代谢产生的不利影响较大。而精液稀释比例过大，精子易受稀释打击，导致有效精子数降低，进一步影响人工授精质量[1-2]。因此生产中普遍采用4～6倍稀释[3]。本试验是在前期工作基础上，进一步探讨本课题组自行研发的猪鲜精17 ℃常温保存稀释剂在高倍稀释下对精子的保护效果。期望在保证精液保存质量的前提下，提高猪精液稀释比例，增加优秀种公猪精液利用率。

1 试验准备

1.1 试验时间

2018年4月-2018年10月。

1.2 试验地点

天津市天泰星火猪人工授精服务中心。

1.3 试验材料与方法

1.3.1 精液采集

试验选取5头进行正常生产的2～4岁大白种公猪，采用手握法采精，收集中段富含精子部分，精子活率达到0.8以上、精子密度在1.5亿/mL以上的原精用于后续试验。

1.3.2 试剂与仪器

主要试剂：果糖、海藻酸钠（上海源叶生物科技有限公司），葡萄糖（天津市光复精细化工研究所），青霉素、链霉素（山东鲁抗舍里乐药品有限公司），甘氨酸、EDTA等（sigma中国有限公司）。

主要仪器设备：CASA计算机自动辅助分析系统（福州鸿视野软件技术有限公司），相差显微镜（蔡司ZEISS），恒温冰箱（青岛畜牧有限公司），电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司），精子快速染液（南京建成生物科技有限公司）。

1.3.3 稀释液配制

BTS：使用分析天平称取 EDTA 1.25 g，碳酸钠1.25 g，柠檬酸钠14.8 g，氯化钾0.75 g，青霉素0.6 g，葡萄糖37 g，硫酸链霉素1 g，使用磁力搅拌器充分溶解于900 mL的灭菌蒸馏水中，调pH至7.2，定容至1 L。

配方组：在BTS稀释液基础中每升添加海藻酸钠1 g，果糖0.2 g和甘氨酸0.4 g。

2 试验设计

本试验在17 ℃恒温条件下，以BTS稀释剂为对照、本课题研发的配方组为试验组，对原精进行1，3，5，10和15倍稀释，以精液有效保存时间、精子活力、质膜和顶体完整性为保存效果的评价指标，试验重复3次。

2.1 精子质量检测方法

精子活力为：直线前进运动精子数占精子总数的比值，此数值通过精子自动分析仪自动检测；质膜完整性采用低渗肿胀试验检测；顶体完整率采用精子快速染液检测。

2.2 数据处理

试验所得的各组数据用Excel进行前期处理，再用SPSS17.0软件进行One-way ANOVA方差分析，并进行多重比较，试验结果用“平均数±标准差”表示，P值大于0.05表示差异不显著，反之则差异显著。

3 试验结果

3.1 不同稀释比例下猪精液有效保存时间研究

本研究中精子活力是指：直线向前运动精子数占总精子数的百分率。有效保存时间是指精液稀释后精子活力维持在60%以上的时间。不同稀释比例猪精液有效保存时间如表1所示。

如表1所示，配方组在各稀释比例下精子有效保存时间均显著高于对照组（P＜0.05）。其中，配方组在5倍和10倍稀释时精液有效保存时间分别为8.77 d和8.43 d，而15倍稀释时配方组中精液有效保存时间明显下降，仅为4.56 d。对照组中，精液最长有效保存时间为3倍稀释下的3.1 d。

3.2 不同稀释比例对精子质膜完整性影响的研究

因为对照组精液有效保存时间最长为3 d，因此本试验检测第3天各稀释比例的猪精子质膜完整性，研究结果如表2所示。

保存第3天时，随着原精稀释比例的升高，对照组与配方组精子质膜完整率均呈现先升高后下降趋势，但配方组质膜完整性均显著高于对照组（P＜0.05）。5倍稀释时，对照组质膜完整率为70%，而配方组质膜完整率为79%；10倍稀释时，配方组精子质膜完整率为82%，对照组则为69%；但15倍稀释时，对照组和试验组质膜完整性均有所下降。

3.3 不同稀释比例对精子顶体完整性影响的研究

同样，本试验检测第3天各稀释比例的猪精子顶体完整性，研究结果如表3所示。

保存第3天时，随着原精稀释比例的升高，BTS组与配方组精子顶体完整率均呈现先升高后下降趋势，但配方组质膜完整性均显著高于对照组（P＜0.05）。5倍稀释时，对照组质膜完整率为76%，而配方组质膜完整率为85%；10倍稀释时，配方组精子质膜完整率为87%，对照组则为73%；但15倍稀释时，对照组和试验组顶体完整性均有所下降。

4 讨论

本科研团队已研发出猪精液高效稀释剂，在17 ℃常温保存可稳定5～7 d，若原精质量较好可有效保存10 d以上[4]；在此基础上本课题还研发了猪精液4 ℃低温保存高效稀释液，进一步延长了猪精液体外保存时间[5]。本试验旨在探讨本课题研发的猪精液17 ℃常温保存稀释液在对猪精原精进行高倍稀释条件下，对精子的保存效果。精液稀释倍数一般要结合精液自身的品质进行确定，生产中常利用精子密度、活率判断稀释倍数[6-8]。张金玲等人利用不同稀释比例探究抗生素种类对精液保存质量的影响，结果表明，常温保存的最佳稀释比例为1∶1～1∶2[9]，但沈培敏等人对猪精液稀释倍数研究发现，稀释倍数为4倍和6倍时精子的活率较高，并且具有较高的受胎率[10]。不同研究结果的出现可能和稀释液的成分组成相关[11]，本试验采用果糖+甘氨酸+海藻酸钠的组合形式，结果表明：随着原精稀释比例的增加，对照组与配方组精子活力、质膜完整率及顶体完整率均呈现先增加后下降的趋势。但配方组对原精采用10倍稀释，保存第3天时，精子活力仍达到60%，质膜完整率为82%，顶体完整率为87%，与对照组相比差异显著（P＜0.05）。表明配方组的海藻酸钠、果糖和甘氨酸有效成分，不仅可以满足高倍稀释精子的营养需要，而且能够较好地降低精液高倍稀释过程所受稀释打击，对精子具有一定保护作用。这可能与海藻酸钠常温条件下能够形成凝胶从而避免蛋白、细胞和酶等活性物质的失活的理化性质相关；罗光彬等人研究发现甘氨酸对冷冻保存精子活力具有较好的维持作用[12]，表明甘氨酸对精子的体外保存也具有一定积极影响，另外，果糖作为精浆的有效组成成分之一，不仅能够直接被精子利用，而且对于精子活力的维持、顶体保护也具有一定作用。这与深林松等人认为果糖对精子运动性能有利的试验结果相一致[13]。综上，本课题组研发的猪精液稀释剂可以对猪原精进行10倍左右的稀释，大大提高了优秀种公猪精液利用率。