橡胶树炭疽病病原菌Colletotrichum laticiphilum生物学特性研究及防治药剂筛选

施玉萍，刘一贤，李岚岚，戴利铭，蔡志英

（云南省热带作物科学研究所，云南景洪666100）

炭疽病是危害我国橡胶树的一种重要叶部病害，在橡胶生产上的危害仅次于橡胶树白粉病，导致该病发生的病原菌主要为胶孢炭疽菌复合群（Colletotrichum gloeosporioidescomplex）和尖孢炭疽菌复合群（Colletotrichum acutatumcomplex）［1-2］。橡胶树炭疽病于1906年在斯里兰卡被首次发现，目前该病已广泛分布于非洲中部、南美洲、亚洲南部和东南部等植胶国家［3］。在我国该病害早期只在苗圃和新植幼树上少量发现，1962年在海南大丰农场开割胶树上首次发现个别品系整年因病落叶，不能割胶，此后在广东的红五月农场及广东徐闻、海康两县各农场引起不同程度落叶。1992年橡胶炭疽病在畅好农场发生大面积流行，发病面积1 550.53 hm2，占开割面积75%，受害割株31.2万株，造成四、五级落叶20多万株，部分林段的胶树因落叶多、枝条枯死，开割时间推迟一个半月，也有部分林段因多次受到炭疽病病菌的反复侵染为害，推迟2～3个月开割，干胶损失达250 t。近年来，由于大量更新和推广高产品系，该病发生日趋严重，1996年仅海南垦区发病面积就达73万hm2，损失干胶15 000 t。广西、云南和福建等各植胶区也陆续报道其发生危害情况［4-6］。2004年，橡胶树老叶炭疽病在云南西双版纳、红河、普洱、临沧、德宏和文山等植胶区不同程度发生。据勐养橡胶分公司调查，2004年8-10月，0.2 hm2橡胶林发生橡胶老叶炭疽病，病重林地的病情指数达3～4级，部分病叶脱落，致使胶乳产量急速下降［7］。

近年来，随着分子系统学方法引入炭疽菌属的分类研究，陆续有一些橡胶树上的新发现病害在国内报道发生，包括C.ledongense、C.australisinense、C.bannanense和C.laticiphilum等［8-9］。由橡胶树炭疽菌C.laticiphilum引起的橡胶树叶部病害是我国新发现为害橡胶叶的一种病原菌，2016年在普洱市孟连增殖苗圃分离获得。该病原菌的培养形态、孢子大小及形态、附着孢大小及形态方面等都与传统的尖孢炭疽菌存在很大的差异，经进一步鉴定，属于尖孢炭疽菌复合群，目前国内尚无相关研究报道，对病原菌生物学特性的研究还处于空白。本文对橡胶炭疽菌C.laticiphilum生物学特性进行了系统研究，为该病害进一步深入研究及防治提供理论基础。

长期以来，化学农药在控制病害过程中发挥了巨大作用，但随着病菌的抗性产生，药效降低，生产上对高效低毒药剂的需求日益迫切。虽然生物防治是抑制病害的一个重要途径，但实际应用较少，在目前尚无优良抗病品种的情况下，化学防治仍是控制病害流行的主要措施。为此，本研究采用菌丝生长速率法测定了4种常用农药对C.laticiphilum的毒力，以期为该病害的防治提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

菌株来源：橡胶叶病菌（C.laticiphilum）采自云南省普洱市孟连农场增殖苗圃，由本项目组分离、鉴定并保存。

供试培养基：PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 18 g，水 1 000 mL)；Czapek 培养基（NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖20 g）；OA（燕麦片琼脂）培养基（燕麦片 50 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL）；CA（胡萝卜琼脂）培养基（胡萝卜200 g，葡萄糖 20 g，琼脂20 g，水1 000 mL）；CMV（玉米粉琼脂）培养基（玉米粉40 g，葡萄糖 20 g，琼脂20 g，水1 000 mL）。

供试药剂：百菌清可湿性粉剂（有效成分含量75%，苏州先正达作物保护有限公司）；代森猛锌可湿性粉剂（有效成分含量80%，北京燕化永乐生物科技股份有限公司）；咪鲜胺水乳剂（有效成分含量450 g/L，江苏辉丰农化股份有限公司）；丙环唑乳油（有效成分含量250 g/L，苏州先正达作物保护有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 不同培养基对菌丝生长的影响

将病原菌菌株接种到PDA平板上进行活化，培养5 d后用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，分别接种到PDA、CA、CMA、OA培养基上，每个处理重复3次，培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.2 温度对菌丝生长的影响

病原菌菌株活化后，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种到PDA培养基上，分别置于5、10、15、20、22、24、26、28、30、35℃共10个温度处理下黑暗培养，每个处理重复3次，培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.3 pH对菌丝生长的影响

将冷却至60℃左右的PDA培养基用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液分别调整pH值为 3、4、5、6、7、8、9、10、11并制成 PDA 平板，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种到不同pH值的平板上，每个处理重复3次，培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.4 不同碳源对菌丝生长的影响

以葡萄糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖、木糖、可溶性淀粉、山梨醇、甘露醇、甘油等11种作为碳源，代替Czapek培养基中的蔗糖，配制不同碳源培养基，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种到不同碳源的培养基平板上，每个处理重复3次，培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.5 不同氮源对菌丝生长的影响

以色氨酸、胱氨酸、L-丙氨酸、酪氨酸、L-精氨酸、甘氨酸、酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白胨、硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸钾等13种作为氮源，代替Czapek培养基中的硝酸钠，配制不同碳源培养基，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种到不同碳源的培养基平板上，每个处理重复3次，培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.6 光照对病原菌生长的影响

设置24 h黑暗、24 h光照（日光灯15 W）、12 h黑暗/12 h光照（日光灯15 W）3种光照条件。将病原菌接种到PDA培养基上，分别置于3种光照条件下培养7 d，每个处理重复3次，观察菌落生长情况。

1.2.7 病原菌菌丝的致死温度

将病原菌菌株接种到PDA平板上进行活化，培养5 d后在菌落表面滴加2 mL无菌水，用无菌棉棒将菌落表面菌丝磨碎，取菌液置于已灭菌的玻璃试管中，在 45、46、47、48、49、50、52℃恒温水浴锅中处理10 min，分别取0.2 mL不同温度处理的菌液涂板于PDA平板培养基上，以一支在室温中放置的试管作为对照，每个处理重复3次，在28℃培养箱中培养5 d后观察菌落生长情况。

1.2.8 病原菌孢子的致死温度

将病原菌菌株接种到PDA平板上，培养5 d后制备孢子悬浮液，10～15个孢子/视野（10×10倍），取孢子悬浮液置于已灭菌的玻璃试管中，在45、48、50、51、52、54、56、58、60℃恒温水浴锅中处理10 min，分别取0.5 mL不同温度处理的孢子液涂板于PDA平板培养基上，以一支在室温中放置的试管作为对照，每个处理重复3次，在28℃培养箱中培养5 d后观察菌落生长情况。

1.2.9 病原菌防治药剂的筛选

用直径5 mm的打孔器在病原菌菌落边缘打取菌饼，接种到含不同浓度杀菌剂的PDA培养基上，每个处理3次重复，以不含杀菌剂的PDA为对照，28℃培养7 d，用十字交叉法测量菌落直径。以药剂浓度对数值为横轴（x），菌落生长抑制率的机率值（y）为纵轴制作毒力曲线，求出毒力回归方程：y=ax+b，并计算不同药剂对病原菌的有效抑制中浓度（EC50）。

菌落生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-5 mm）×100

1.2.10 数据统计

采用SPSS Statistics 24、Origin 8.5数据分析软件。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对病原菌菌丝生长的影响

病原菌在PDA、CA、OA、CMA四种培养基上均能正常生长，PDA培养基上生长最快，7 d后菌落生长直径达71.63 mm，PDA、CA培养基上气生菌丝茂盛，而CMA培养基气生菌丝稀薄（图1）。

2.2 温度对菌丝生长的影响

由图2可看出，橡胶树炭疽病病原菌在10～35℃都能生长，5℃不能生长。适宜温度范围为22～30℃ ，培 养 7 d 后 菌 落 直 径 在 59.84～72.72 mm，最适温度为26℃，培养7 d后菌落直径达到72.72 mm，病原菌菌丝在超过30℃时对温度比较敏感。

2.3 pH对菌丝生长的影响

病原菌菌丝在pH 3～11范围内均能生长，在pH 5～7均有较好长势，最适生长pH值为6，培养7 d后菌落直径达73.11 mm。病原菌对酸碱的适应范围比较广，但更适宜在酸性环境下生长（图3）。

图1 不同培养基对菌丝生长的影响及不同培养基上的菌落形态

图2 温度对菌丝生长的影响

图3 p H对菌丝生长的影响

图4 不同碳源对菌丝生长的影响

2.4 不同碳源对菌丝生长的影响

对11种不同碳源进行比较之后发现，病原菌对可溶性淀粉利用最好，菌丝生长较快，培养7 d后菌落直径达到62.07 mm，其次是山梨醇，菌落直径为55.22 mm，含有乳糖、半乳糖的培养基上的病原菌长势较慢，菌落直径分别为39.63 mm和32.19 mm（图4）。

2.5 不同氮源对菌丝生长的影响

由图5可知，在含有13种不同氮源培养基上，病原菌在含牛肉浸膏的培养基上长势最快，对氮源的利用率最高，培养7 d后菌落直径达到70.65 mm。硫酸铵和氯化铵对病原菌有明显的抑制作用，菌落直径分别为16.65 mm和19.45 mm。说明病原菌对有机氮源和无机氮源都能利用，有机氮源更有利于病原菌菌丝的生长。

图5 不同氮源对菌丝生长的影响

2.6 光照对病原菌生长的影响

观测结果表明（表1），24 h光照条件更有利于菌丝生长，并且在光照条件下有利于产生色素。光暗交替的条件更有利于孢子产生，黑暗条件不利于菌丝生长。

表1 光照对病原菌菌丝生长的影响

2.7 病原菌菌丝的致死温度

实验设置了7个温度对病原菌菌丝进行处理（表2），在温度45～49℃条件下菌丝均能形成新菌落，在50℃条件下不能形成新菌落，说明病原菌菌丝的致死温度为50℃，10 min。

表2 病原菌菌丝致死温度

2.8 病原菌分生孢子的致死温度

实验设置了7个温度对病原菌分生孢子悬浮液进行处理（表3），在45～49℃处理下分生孢子均能萌发形成新菌落，在50℃处理下不能形成新菌落，说明病原菌分生孢子的致死温度为50℃，10 min。

2.9 病原菌防治药剂的筛选

室内毒力测定结果（表4）表明，4种杀菌剂对病原菌的毒力存在明显差异，其中咪鲜胺和丙环唑的毒力最强，EC50分别为0.1286和0.5208 mg/L。供试药剂毒力回归方程相关系数均大于0.9，说明药剂不同浓度间抑菌率相关性较高，推算出的EC50较准确。

表3 病原菌分生孢子致死温度

表4 不同杀菌剂对橡胶树炭疽菌的室内毒力测定

3 讨论

迄今为止，橡胶树炭疽病C.laticiphilum只在哥伦比亚和印度有报道发生，但都没有其生物学性状及化学防治的相关研究报道。我们在病害调查过程中首次发现在我国胶园中存在该病害，且该病害的发病率高达86%，严重影响橡胶树的正常生长。经对该病害的生长性状及防治药剂进行研究，C.laticiphilum在10～35℃都能生长，最适生长温度为26℃。该病原菌对酸碱的适应范围比较广，菌丝在pH 3～11范围内均能生长，最适生长pH值为6。菌丝在50℃条件下处理10 min停止生长，分生孢子在50℃条件下处理10 min停止萌发；通过对11种不同碳源进行比较之后发现，病原菌对可溶性淀粉利用最好，其次为山梨醇，对13种氮源比较后发现，病原菌在含牛肉浸膏的培养基上长势最快，对氮源的利用率最高。病原菌在完全光照条件下生长最好，该结果与前人研究橡胶树炭疽菌的最适生长温度、最适酸碱度、碳氮源利用等方面都有所差异［10-15］。经研究发现，该病原菌菌丝生长及分生孢子萌发对自然环境的适应范围与我国植胶区的环境条件较为一致，是典型的热带地区病原菌。病原菌在我国植胶区如遇合适的气候因素很可能会引发病害的大流行，威胁我国天然橡胶产业。因此，有必要对该病害对杀菌剂的敏感性进行研究，以便应对这种潜在威胁。

咪鲜胺和丙环唑是一种广谱杀菌剂，对由子囊菌、担子菌和半知菌引起的病害具有明显的防效，而百菌清和代森猛锌是广谱、非内吸保护性杀菌剂，广泛用于果树、蔬菜以及大田作物，可防治多种重要的叶部真菌病害，本研究选用了这4种杀菌剂进行室内毒力测定。结果表明，咪鲜胺、丙环唑、百菌清、代森猛锌对病原菌的毒力存在明显差异，咪鲜胺和丙环唑的毒力最强，而百菌清和代森猛锌毒力较弱，该结果与陈怡志［16］、曹学仁［17］等对炭疽菌防治药剂研究结果一致，而与王兰英［18］、崔昌华［19］、胡晓颖［20］等的又有所差异。因而对该病菌的防治药剂筛选也变得尤为重要，只有筛选出有效药剂才能在实际生产中指导该病害的防治，起到高效防治病害的作用，同时也避免杀菌剂的滥用。近年来，国内外利用微生物制剂、植物源制剂及诱抗剂等对链格孢属真菌引起的植物病害进行生物防治，取得了一定的效果。例如日本研发的多氧霉素和我国研发的多抗霉素对烟草赤星病、苹果斑点落叶病具有显著的效果，张月凤［21］等研究发现生防放线菌CY-14发酵液对香蕉炭疽病具有显著的防治效果。谷春艳［22-23］等研究发现解淀粉芽孢杆菌与化学药剂复配能对草莓炭疽病及灰霉病的防治有增效作用。因此，对于橡胶树叶部病害的防治，在采取传统化学药剂防治的同时，我们也应考虑结合其生物学特点，积极研发有效的微生物制剂、农用抗生素、微生物与化学药剂复配剂等新型农药。