脑梗死患者脑微出血与血管内皮损伤标志物ICAM-1、eNOS、sTM的相关性

凌丽何龙

(1.河北大学医学院，河北 保定 071000；2.河北大学附属医院，河北 保定071000)

脑微出血(cerebral microbleeds, CMBs)是指脑内微小血管破裂或微量血液渗漏导致的脑实质亚临床损害，CMBs后，含铁血液溶解成分被吞噬细胞吞噬，形成含铁血黄素的高度顺磁性物质，沉积在脑微小血管周围，在磁敏感加权成像(susceptibility weighted imaging, SWI)中，其表现为低信号区域或信号缺失区域[1]。CMBs的确切发病机制仍有待研究，据报道称其与血管内皮及血-脑脊液屏障的破坏有关[2]，前者的破坏以及激活都能够借助对循环中的血清进行检验，根据其中的可溶性内皮标志物的情况来评判，血管内皮损伤标志物细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion factor-1，ICAM-1)、内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、可溶性血栓调节蛋白(soluble thrombokinin，sTM)含量可以通过不同的方面反应内皮功能，本文通过脑梗死(cerebral infarction,CI)患者的病例对照研究，观察上述指标的变化，并探讨其与CBMs在CI中的相互关系和临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集河北大学附属医院2017年7月至2018年6月于神经内科住院的脑梗死患者106例，经颅脑SWI检查确诊无CMBs(I组)37例(男22例，女15例)，年龄(59.36±9.79)岁，3个月后失访6例；合并CMBs(Ⅱ组)69例(男43例，女26例)，年龄(66.84±10.36)岁，3个月后失访1例。首次发病，入院时病程72 h以内，符合中国急性缺血性脑卒中诊疗指南 2014 版急性缺血性脑卒中(脑梗死)诊断标准，实验操作经患者及患者家属同意，并签署相关知情同意书，同时经医院伦理委员会批准。排除脑梗死合并颅内血肿、脑出血、脑血管畸形、颅内肿瘤、脑淀粉样变性、单纯脑叶微出血，既往梗死史、血管疾病、恶性肿瘤、严重脏器疾病和中枢神经系统感染者，排除服用抗血小板药物或抗凝药物，经检查凝血指标异常者以及由于其他原因不能依从完成实验研究、拒绝签字者。

1.2 研究方法

1.2.1 数据采集

就106例已经确定的脑梗死急性期患者，记录其一般情况，包括年龄、性别、高血压病史、血脂情况、糖尿病史、冠心病史、饮酒史、吸烟史。纳入研究的所有对象均需空腹大于12 h，次日凌晨抽取患者的肘正中静脉血4 mL，采用枸橼酸钠抗凝胶管进行装载；所有采血管完成上述操作后进行10 min的冰浴处理，后用Thermo Fisher PR121型高速离心机以“3 000 r/min，10 min”进行离心处理，提取上层血清，分装于冻存管中，储存于-80 ℃冰箱等待进一步处理。

1.2.2 指标测定

本研究采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)定量分析和测定人体血清中ICAM-1、eNOS和sTM含量，吸光度的测量使用EPOCH全波长酶标仪，2组患者血清ICAM-1、eNOS和sTM含量测定所用试剂均购自于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，产品编号为ICAM-1(E-EL-H2585c)、sTM(E-EL-H0166c)、eNOS(E-EL-H0755c)。2组患者发病3个月后，再次进行血清检查，测定恢复期以上因子的含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 患者一般资料

收集2组患者的一般资料，并对2组的基本资料进行比较，结果显示：年龄和高血压病是导致脑梗死患者CMBs有意义的影响因素(P<0.05),其他指标2组间的差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 I组和Ⅱ组患者一般资料比较

2.2 患者血清指标

将2组血管内皮损伤标志物含量进行比较，急性期患者中Ⅱ组患者ICAM-1、sTM和eNOS含量较I组患者均明显高，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)；而3个月之后的复查结果显示，I组、Ⅱ组患者之间ICAM-1、sTM和eNOS含量的差异依然有统计学意义(P<0.05)，值得注意的是eNOS含量在恢复期的比较中合并CMBs组即Ⅱ组明显低于无CMBs组即I组(表3)。

表2 I组和Ⅱ组急性期ICAM-1、eNOS和sTM含量比较

表3 I组和Ⅱ组组治疗3个月ICAM-1、eNOS和sTM含量比较

2.3 CMBs危险因素分析

将上述急性期研究结果有统计学意义的变量纳入Logistic回归分析, 结果显示: 急性期ICAM-1、eNOS、sTM含量是影响患者发生CMBs的独立危险因素, 差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4 影响患者发生CMBs的Logistic回归分析

2.4 ROC曲线

进一步探究血浆内皮损伤标志物与脑梗死患者发生CMBs的相关性， 以血浆内皮损伤标志物的含量为预测指标，以患者是否出现CMBs为结局事件，探究ICAM-1、eNOS、sTM含量对患者CMBs的预测价值，结果显示：sTM曲线下的面积为0.765，预测脑梗死患者发生CMBs的敏感性为0.875，特异性为0.752；ICAM-1曲线下面积为0.746，预测脑梗死患者发生CMBs的敏感性为0.824，特异性为0.726；eNOS曲线下面积为0.728，预测脑梗死患者发生CMBs的敏感性为0.764，特异性为0.687(图1)。

图1 ICAM-1、eNOS、sTM预测患者CMBs的ROC曲线

3 讨论

CMBs为临床诊疗方面带来了不可忽视的影响。然而，诊疗中发现CMBs的方法寥寥无几。到目前，最常使用的CMBs诊断方法为序列SWI和梯度回波(gradient recalled echo,GRE)T2*WI。将二者进行比对分析可知：前者的成像基础组织间磁敏感度的差异，根据含铁量的情况能够帮助实现磁化率成像。SWI具备对局部磁场变化非常高的敏感性，哪怕是含铁血黄素所带来的微小变化，都能够被识别。而后者并不可以减少磁场的不均匀信号，所以即使磁场变化差异极其细微，GRE也可以非常清楚地显示变化。将这2个类别的序列进行研究比对发现，SWI具有三维立体、高分辨率、高信躁比等特点。SWI序列可以消除由于磁场不均匀而产生的去相位效应，而GRE序列却无法消除该效应。因此综合来看SWI在对CMBs病灶的指示作用非常关键，其形态特征以及内部结构都能够通过SWI相对确切地显示[3-4]。因此，此次研究选择以SWI序列检查结果作为CI合并CMBs组的入组标准。但是，目前在实际临床应用中，核磁共振检查尤其是特殊序列并非一种常规的检查手段，这也是后续的研究工作需要着重解决的问题。

血管内皮细胞损伤是CMBs形成的重要机制[5]，血管内皮的主要功能包括机械与化学屏障功能、调节血管张力和炎症免疫反应、调节血液有形成分，而血浆ICAM-1、eNOS和sTM含量的变化分别可以反映这些功能的损伤情况。ICAM-1即CD54，其分子量76～114，是一种单链糖蛋白[6]。在正常生理条件下ICAM-1的表达量很低，但在受缺血性刺激和组织炎症反应过程中由于组织内毒素和细胞因子的作用，让血浆内的ICAM-1的含量明显提高。ICAM-1可以在相应细胞因子的激活作用下与白细胞表面所表达的配体相结合，介导外周血白细胞与血管壁接触，在内皮细胞上滚动和稳定粘附，穿越血管表层，启动局部的炎性反应并促进白细胞诱导的小血管壁损伤，导致血-脑脊液屏障的崩解。eNOS与神经源型NOS(nNOS)以及诱导型NOS(iNOS)组成NOS的三种分型，其中又与nNOS并称为结构型NOS(cNOS)。血管内皮损伤后eNOS释放出的NO可以通过抑制血管收缩剂ET-1、促细胞分裂剂和血管收缩剂PDGF-BB的基因转录水平，从而起到调控血管张力的作用[7-8]。另一方面，内皮源性的NO还可以通过cGMP途径，起到抗血小板凝集和粘附的作用，从而保护血管内皮，进而起到保护颅内神经的作用[9]。在血管性疾病中由iNOS和nNOS产生的NO也会大量出现，这部分NO可以藉由介导谷氨酸、削弱细胞线粒体功能、引起多巴胺大量释放和介导炎症反应等途径对神经细胞产生毒性作用[10]。sTM是一种具有抗凝作用的糖蛋白,能够介导蛋白 C 活化从而达到调节血液凝固目的，是使凝血酶由促凝转向抗凝重要的血管内凝血抑制因子。血管内皮损伤时，血栓调节蛋白脱落，其循环血中含量会显著升高。作为同型半胱氨酸蛋白酶抑制剂系统的主要组成部分，sTM与凝血酶在相关刺激作用下相互结合形成复合物，激活同型半胱氨酸蛋白酶抑制剂系统，进一步防止血栓形成[11]。本研究Ⅱ组患者血清ICAM-1、eNOS和sTM含量相比I组均明显高，提示以上指标的含量变化可作为判断脑梗死患者有无合并CMBs与病情进展情况的标志物。在分析脑梗死急性期CMBs与ICAM-1、eNOS和sTM的相关后，患者3个月来院复查时又一次采取血样，进行了脑梗死恢复期有无CMBs患者之间ICAM-1、eNOS和sTM的比较和分析。但是在患者急性期到恢复期这一段时间之内，入组的患者出现了包括失联、不愿来院复查、复发脑梗死等情况，故有一部分入组患者在本次实验恢复期部分被排除。研究结果显示，Ⅱ组患者脑梗死恢复期的血清内ICAM-1和sTM水平依旧明显高于I组患者, 而I组患者恢复期的血清内eNOS水平反而明显高于Ⅱ组患者。这进一步说明CMBs的发病与慢性血管内皮损伤关系密切，而Ⅱ组患者恢复期eNOS水平低于I组可能是由于神经元中存在对NOS的负反馈调节过程[12]，也有报道称组织缺氧可以通过转录及转录后机制对eNOS的表达产生抑制作用[13]。

通过Logistic回归分析发现ICAM-1、急性期的eNOS和sTM均为脑梗死后CMBs的独立危险因素。以往的研究已经证实了高血压、年龄、动脉粥样硬化为脑梗死后CMBs的独立危险因素[14]，而对于内皮损伤标志物与脑梗死后CMBs的相关性却鲜有报道。随着内皮损伤标志物ICAM-1、eNOS和sTM在血浆内的含量升高，代表着血管内皮的损伤程度也越来越重，使更多血浆红细胞渗漏进入周围脑组织，进而导致CMBs的发生。

ROC曲线是一种为了检测不同诊断标准时的灵敏度和特异性用图的形式表现出来的曲线，其曲线下面积是判断某种诊断方法准确性的依据，代表了此种诊断方法在临床应用的价值[15]。此次研究表明，血浆ICAM-1、eNOS和sTM水平的变化是预测CI患者是否并发CMBs的良好诊断依据。

综上所述，脑梗死后微出血是一个极端复杂的病变过程，脑组织坏死所引起的各种指标都处在动态变化中，脑梗死具有高发病率、高发作性、高致残率、高致死率等特点，而CMBs的出现更加剧了患者脑神经的损伤，增加了继发各种其他病症甚至死亡的风险，且针对性的治疗方法有限，因此，对各种危险因素的重视与监测预防越来越有必要，有必要将ICAM-1、eNOS和sTM作为脑梗死后CMBs的常规检查项目联合检测，有效采取相应的临床治疗手段，对减慢和阻止脑组织损伤的出现和发展有极为重要的临床意义，对其预后也有深远的影响。

致谢：感谢河北大学附属医院中心试验室与影像科对本研究的支持！