新疆葡萄干多酚超声波辅助提取工艺响应面法优化研究

谢 辉，王 仙，张 雯，伍国红，王 敏，韩守安，玛尔哈巴·毛拉洪，依扎提·吐尔达洪，钟海霞，潘明启，陆胜祖，李 疆

(1.新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐，830091；3.新疆农业科学院粮食作物研究所，乌鲁木齐 830091；4.新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200；5.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】葡萄产业是新疆林果业的支柱产业之一，近年来新疆葡萄干的产量和制干品种栽培面积持续发展[1，2]。目前新疆葡萄干品种主要有无核白、无核白鸡心(香妃)、无核紫、索索葡萄干、马奶子及其他品种的葡萄干[2，3]。多酚具有抗癌、抗老化等抗氧化作用，对人体健康具有积极的意义[4,5]。葡萄干含有黄酮、多糖、多酚等多种生物活性物质，具有较高的活性及营养保健功能，是日常膳食中重要的保健食品[6-9]。研究葡萄干中多酚的提取工艺及检测方法，对新疆葡萄干产业的发展具有重要意义。【前人研究进展】关于植物中多酚提取工艺的研究在桑叶[10]、葡萄皮渣[11]、蓝莓叶[12]、石榴[13]、苹果[14]、无花果[15]等果树上已进行了大量的研究，采用超声波辅助工艺提取植物中的多酚物质可以有效提高提取率[16]。对于不同物料的提取条件具有较大的差异，例如桑叶的多酚提取时间为16 min，料液比为1∶87(g/mL)，而蓝莓叶则是2.06 h和1∶23.65(g/mL)；采用超声辅助提取后可显著缩短提取时间和提取温度，对于加快提取效率，节约能耗具有重要的作用[16]，采用超声辅助方法对不同果实多酚提取工艺优化发现，不同物料之间的提取条件也具有较大的差异，葡萄皮渣中的料液比为1:16(g/mL)，而无花果干则为1:45(g/mL)，乙醇体积分数分别为40%和60%。【本研究切入点】葡萄干加工过程损耗较少关于高糖材料中多酚物质提取工艺研究较少。研究葡萄干中多酚含量的方法进行优化研究以新疆干果产业中的葡萄干产业为研究对象，研究葡萄干中多酚物质的提取工艺，为测定葡萄干中多酚含量提供技术支撑。【拟解决的关键问题】测定不同工艺条件下葡萄干中多酚物质含量，为制干工艺的改进奠定理论基础和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

材料为马奶子葡萄干，2016年鲜样采集于鄯善瓜果研究中心品种资源圃内，并在晾房中晾制成干。无核白鸡心、无核紫、无核白、SP522、皇家秋天、巨玫瑰、紫玉、红宝石、红玉、茉莉莎等品种由鄯善葡萄研究所提供。

试剂：无水乙醇(分析纯)、福林酚试剂(分析纯)、碳酸钠(分析纯)、没食子酸(优级纯)。

仪器：德国IKA/艾卡 A11 基本型分析研磨机、721型紫外分光光度计、超声仪(功率150W)、万分之一电子天平、高速冷冻离心机。

1.2 方 法

1.2.1 样品处理

将葡萄干样品带回实验室内，除去杂质，随机称取3份100 g葡萄干，采用液氮速冻，研磨成粉，迅速称取1.00 g样品多份，保存于﹣40℃冰箱中待测。

1.2.2 标准曲线的制作及提取液多酚含量测定

多酚得率的测定方法参照令博等[11]测定葡萄皮渣多酚含量的方法略作修改，取试管，分别加入5 mL蒸馏水，1 mL FC试剂和3 mL 7.5% Na2CO3溶液，室温避光放置90 min后，在波长760 nm处测吸光度，得到没食子酸质量浓度ρ(μg/mL)与吸光度A的回归方程：ρ=333.33A+0.045(R2=0.999 6)，用同样的方法测定样品中多酚含量。多酚得率的计算公式如下Y(%)=(cxv)/m(c为提取液多酚质量浓度(以没食子酸计)，mg/m；V为提取液定容体积，m；m为葡萄干粉末质量，g；Y为提取液中多酚得率，mg/g。)

标准曲线：Y=69.105 1C(标准液浓度)-0.021 0；R2=0.999 5。

1.2.3 多酚提取优化

准确称取1.00 g样品置于容积为100 mL的烧瓶内，加入一定比例及体积分数的乙醇溶液，在一定温度下回流提取一定时间后过滤。滤渣以同样条件提取、过滤，合并滤液，测定吸光度。

最佳乙醇提取浓度：分别设置了20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇浓度提取试验，进而得出最佳的乙醇提取浓度试验结果。

最佳料液比：选用最佳的乙醇提取浓度，分别设置了20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1的料液比提取试验，在此基础上得到最佳的料液比提取方案。

最佳提取时间：根据最佳乙醇浓度、最佳料液比的试验结果，分别设置了15、30、45、60、75、90 min的提取时间梯度试验，得到最佳的提取时间试验。

最佳提取温度：根据乙醇浓度、料液比和提取时间的试验结果，对超声提取的温度进行优化，分别设置了30、40、50、60、70℃的温度试验梯度，最终得出最佳的提取温度。

1.2.4 响应面分析

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken软件设计试验方案，以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、温度(D)为自变量，以多酚得率y设计响应面因素水平表。表1

表1 Box-Behnken的中心组合因素水平表
Table 1 The central combination factor level table of Box-Behnken

水平level乙醇浓度ethanol concentration(%)料液比solid-liquid ratio(mL/g)温度Temperature(℃)时间Time(min)-140505540050606550160707560

1.3 数据处理

采用Excel和Design-Expert 8.0软件对结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 葡萄干多酚最佳提取工艺的乙醇浓度筛选

不同乙醇浓度影响葡萄干样品中的多酚提取率，不同乙醇浓度多酚提取量分别为20%时提取率为1.11 mg/g、30%时提取率为1.13 mg/g、40%时提取率为1.19 mg/g、50%时提取率为1.23 mg/g、60%时提取率为1.20 mg/g、70%时提取率为0.99 mg/g、80%时提取率为0.75 mg/g、90%时提取率为0.46 mg/g。无核白鸡心葡萄干中的多酚随着乙醇浓度的增加而逐渐增加，当乙醇浓度为50%时，多酚得率最大，当乙醇浓度大于50%时，得率反而下降。最佳的乙醇浓度选取为50%。图1

图1 不同乙醇浓度下葡萄干多酚提取率变化
Fig. 1 Effect of Ethanol Concentration on Extraction Rate of Polyphenols from Raisins

2.1.2 葡萄干多酚最佳提取工艺料液比筛选

多酚的提取率与提取液的体积密切相关，不同料液比多酚提取量分别为1∶220时提取率为0.88 mg/g、1∶230时多酚含量提取率为0.92 mg/g、1∶240时多酚提取率为0.94 mg/g、1∶250时多酚提取率为0.99 mg/g、1∶260时多酚提取率为1.01 mg/g、1∶270时多酚提取率为0.98 mg/g。料液比在1∶20(g/m)～1∶260(g/m)，随料液比增加得率增加，料液比在1∶260(g/mL)时，多酚得率达到最高值，料液比大于1∶260(g/m)时，当料液比为1∶270(g/m)、多酚提取率没有明显的增加。分析原因可能是随着料液比的增大，使葡萄干样品颗粒与乙醇试剂之间的接触面积逐渐增大，提高了酚类物质向溶剂溶解的比例，使得多酚的提取率增大；然而当料液比超过一定比例后，多酚提取率已经达到饱和，当料液比超过1∶260(g/m)时，葡萄干样品中的多酚提取率没有明显变化。最适料液比选择为1∶260(g/m)。图2

图2 不同料液比下葡萄干多酚提取率变化
Fig. 2 Effect of liquid-to-liquid ratio on extraction rate of raisin polyphenols

2.1.3 葡萄干多酚最佳提取工艺的提取时间筛选

提取时间与多酚的提取率密切相关，不同提取时间条件下多酚提取量分别为15 min时提取率为0.769 mg/g、30 min时提取率为0.70 mg/g、45 min时提取率为0.76 mg/g、60 min时提取率为0.80 mg/g、75 min时提取率为0.86 mg/g、90 min时提取率为0.83 mg/g。在15～90 min时，随提取时间的增加，得率也逐渐增大，在75 min时达到最大，随着提取时间的增加，葡萄干样品被溶剂充分浸透，同时由于超声波的作用，加速葡萄干样品中的酚向溶剂溶出；当提取时间大于75 min时，葡萄干样品中的多酚得率反而下降提取时间过长，超声产生的空化作用和机械震动可能对多酚有一定的分解作用，也会加大部分杂质的溶出，使得提取率降低。试验选取的多酚最佳选择提取时间为75 min。图3

图3 不同提取时间下葡萄干多酚提取率变化
Fig. 3 Effect of extraction time on extraction rate of raisin polyphenols

图4 不同提取温度下葡萄干多酚提取率变化
Fig. 4 Effect of extraction temperature on extraction rate of raisin polyphenols

2.1.4 葡萄干多酚最佳提取工艺的提取温度筛选

提取温度对葡萄干样品中多酚的提取影响较大，不同温度条件下多酚提取量分别为30℃时提取率为0.73 mg/g、40℃时提取率为0.81 mg/g、50℃时提取率为0.85 mg/g、60℃时提取率为0.96 mg/g、70℃时提取率为1.02 mg/g、80℃时提取率为0.98 mg/g。提取温度在30～70℃，随温度的升高，得率随之增大，当提取温度为70℃时得率达到最大。随着温度的升高，提取液黏度下降，扩散系数增加，加快了分子热运动的速度，促进物质的溶出。但当温度大于70℃时，多酚得率反而下降可能是因为温度过高，导致多酚的组织结构被破坏，氧化分解，温度过高会导致溶剂损失，并且杂质大量溶出，影响多酚的提取效果。最佳提取温度选取为70℃。图4

2.1.5 葡萄干多酚最佳提取工艺的暗反应时间筛选

随着暗反应时间的延长多酚提取率测定值下降，10 min测定值为1.93 mg/g，15 min测定值为1.86 mg/g，暗反应为25 min时测定值为1.84 mg/g，暗反应40和120 min时的测定值与25 min时测定值一致，确定多酚暗反应时间为40 min。图5

图5 不同暗反应时间下葡萄干多酚提取率变化
Fig. 5 Effect of dark reaction time on extraction rate of raisin polyphenols

2.1.6 葡萄干多酚最佳提取工艺的超声波功率

研究表明,随着超声波功率的增加提取效率逐渐增高，不使用超声波提取率为0.62 mg/g，超声波功率为30%提取率0.79 mg/g，超声波功率为60%提取率0.86 mg/g，超声波功率为100%提取率0.96 mg/g，超声波震动致使细胞壁破解并加速了多酚的提取，且随着提取功率的增加提取也更加稳定，确定使用最大功率。图6

图6 不同超声波功率下葡萄干多酚提取率变化
Fig. 6 Effect of ultrasonic power on extraction rate of raisin polyphenols

2.2 响应面

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken软件设计，对葡萄干中多酚提取进行四因素三水平优化试验设计，结果。表2

通过Design-Expert 8.0.6.1软件进行二次响应面回归分析，以多酚得率为响应值，经回归拟合后得到回归方程为Y=3.535 8+0.145 83×X1+0.168×X2+0.032×X3-0.004 92×X4+0.163×X1X2-0.028 75×X1X3+0.009×X1X4+0.311×X2X3+0.011×X2X4-0.160 75×X3X4-0.259 53×X12-0.409 65×X22-0.177 4×X32-0.074 53×X42

表2 超声波辅助提取葡萄干中多酚的响应面试验
Table 2 Experimental design and results for the response surface analysis to optimize the ultrasonic assisted extraction of polyphennols from raisin

试验号Test number乙醇浓度Ethanol concentration(%)料液比Solid- liquid ratio(mL/g)温度Temperature(℃)提取时间Extraction time(min)多酚提取量Extraction rate of polyphenols(mg/g)100113.1222001-13.459301103.4394-1-1002.69551-1002.649600003.4957-100-13.103801-102.791911003.3171010-103.24411010-13.232

续表2 超声波辅助提取葡萄干中多酚的响应面试验
Table 2 Experimental design and results for the response surface analysis to optimize the ultrasonic assisted extraction of polyphennols from raisin

试验号Test number乙醇浓度Ethanol concentration(%)料液比Solid- liquid ratio(mL/g)温度Temperature(℃)提取时间Extraction time(min)多酚提取量Extraction rate of polyphenols(mg/g)120-1012.8741300003.4991400003.51715100-13.3351600003.626170-10-12.8981800003.5421910103.29220-10013.073210-1-103.1032200-1-13.0772300-113.38324-10103.03625-11002.711260-1102.50727-10-102.8732810013.3412901013.252

该模型效应极显著(P<0.000 1)，失拟项P=0.858>0.05，表明差异不显著，获得回归模型线性回归方程相关系数R2=0.990 4，说明99.04%响应值的变化是由独立变量决定的。此外模型变异系数CV=1.33%，证明该试验值精密度及可靠性符合要求。因此，该模型拟合符合统计学需求，葡萄干中多酚提取最佳工艺可用此模型预测。根据F值可知，影响多酚提取的几个因素重要性依次为料液比>乙醇浓度>温度>提取时间。表3

用Design-Expert8.0.6软件绘制与多酚相关的响应面图，分析结果发现料液比与乙醇浓度、温度与料液比、温度与乙醇浓度、提取时间与料液比四组交互性较强，经过对图7中各因素交互性进行分析发现料液比与乙醇浓度对试验的影响最为显著，因此，其曲线最为陡峭，其次为温度与料液比。由此可见，料液比与乙醇浓度的交互作用最为显著。图7

2.3 最佳工艺及验证

分析回归模型，得出最佳提取条件为：乙醇浓度为54.2%，料液比68.3 m/g，提取温度为79.9℃，提取时间为34.4 min，模型预测总黄酮提取率为3.663 4 mg/g。对模拟结果进行优化，得到提取工艺为乙醇浓度54%，料液比68∶1(m/g)，提取温度75℃，提取时间35 min，进行3次平行试验，得到多酚提取率平均值为3.599 2 mg/g，与模型预测值基本一致，说明该模型可以用来预测葡萄干中多酚提取率。

表3 响应面模型方差
Table 3 Analysis of variance for thetted response surface model

来源Source自由度Degree of freedom平方和Sum ofsquares均方Mean squareF值F valueP值P value模型model142.547 4260.181 959103.317 1< 0.000 1∗∗乙醇浓度Ethanol concentration10.237 1640.237 164134.662 8< 0.0001∗∗料液比Solid-liquid ratio10.338 6880.338 688192.308 5< 0.000 1∗∗温度Temperature10.012 2880.012 2886.977 1790.019 3∗提取时间Extraction time10.000 290.000 290.164 7110.691NAB10.106 2760.106 27660.343 97< 0.000 1∗∗AC10.003 3060.003 3061.877 3030.192 2NAD10.000 3240.000 3240.183 9690.674 5NBC10.386 8840.386 884219.674 4< 0.000 1∗∗BD10.000 4840.000 4840.274 8170.608 3NCD10.103 3620.103 36258.689 53< 0.000 1∗∗A210.436 8860.436 886248.065 6< 0.000 1∗∗B211.088 5181.088 518618.064 9< 0.000 1∗∗C210.204 1350.204 135115.908 5< 0.000 1∗∗D210.036 0260.036 02620.455 60.000 5∗∗残差Residual140.024 6560.001 761失拟项Lack of fit100.013 110.001 3110.454 1370.858N纯误差Pure error40.011 5470.002 887总和Sum total282.572 083R2=0.990 4CV=1.33%

2.4 葡萄干品种中多酚含量的比较

对新疆主要的制干葡萄品种无核白、无核紫、无核白鸡心及其他制干葡萄品种中的多酚类物质检测发现鄯善葡萄瓜果研究所的葡萄干品种中SP522的多酚含量最高，其次为巨玫瑰、皇家秋天两个有核品种，无核紫多酚含量排在第四位，新疆主要的制干葡萄品种中无核紫葡萄干无核紫多酚含量最高，无核白鸡心次之，无核白多酚含量最低，分别为2.08、0.96和0.82 mg/g,其他品种中SP522葡萄干多酚含量最高，达到3.94 mg/g。

3 讨 论

葡萄干最佳提取工艺与其他鲜果[11、13、14]、鲜叶等样[10、12]品的最佳提取工艺相比，料液比显著升高，与鲜果相比提取液乙醇浓度升高，提取温度、提取时间相比较一致。葡萄干中的高糖物质是影响葡萄干中多酚提取的关键因素，主要体现在以下两个方面：(1)由于葡萄干高糖的特性，不易研磨，容易凝结成团，不利于提取有效物质成分；(2)在提取过程中提取物质容易粘到试管壁上，需要不断的搅拌混匀。经试验发现，将乙醇浓度提升到54%后，样品结团、挂壁的现象显著改善；采用超声提取后避免了重复之间系统性误差较大、数据不准确的现象。

对新疆不同品种葡萄干多酚含量测定结果显示，SP522多酚含量最高，SP522是一个无核品种，成熟期较早，制干特性也较好，是一个具有较高价值的葡萄干品种。目前主流葡萄干品种中无核紫含量高于其他两个品种可能与无核紫是黑色，其他两个品种是绿色葡萄干品种。

图7 各因素交互作用影响多酚提取量的响应面
Fig. 7 Response surface graphs showing the interactive effects of various factors on the yield of polyphenols

图8 新疆主要葡萄干品种多酚含量对比
Fig. 8 Comparison of polyphenol content in main raisin varieties in Xinjiang

4 结 论

超声波辅助条件下葡萄干中多酚物质的最佳提取工艺是：乙醇浓度54%，料液比68∶1(m/g)，提取温度75℃，提取时间35 min，此工艺条件下葡萄干多酚提取率平均值为3.359 2 mg/g，暗反应时间40 min。新疆主要的制干葡萄品种中无核紫葡萄干多酚含量最高，无核白鸡心次之，无核白多酚含量最低，分别为2.08、0.96和0.82 mg/g,其他品种中SP522葡萄干多酚含量最高，达到3.94 mg/g。