通过可调控Lhx2的表达制备小鼠造血干细胞系

杜江龙，曹 欣，薛宇佳，许 强，杨学才，蔡葵蒸*

(1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

【研究意义】造血干细胞可以基于细胞表面标志物而分离获得，它具有再生和移植于免疫缺陷小鼠后维持功能性血液系统的独特能力[1]。造血干细胞在临床应用方面的重要性以及分离造血干细胞的能力，导致开发了多种不同的体外扩增造血干细胞的培养系统[2-5]。使用这些不同的培养系统扩增造血干细胞仅取得了有限的成果，因为调控造血干细胞自我更新过程的分子和细胞机制大部分仍未知[6]。体外扩增造血干细胞的另一条途径是通过遗传操作使它们永生化，使用这种方法可建立干细胞样细胞系。这些细胞系中的大多数或者在移植后产生功能性血液细胞的能力有限，或者在这方面远未进行充分地分析[7-10]。【前人研究进展】有报道称一株造血干细胞系可以在体内产生功能性细胞，但导致其永生化的遗传事件却未知[11]。因此，这个细胞系的产生难以轻易复制。有研究者在来源于胚胎干细胞体外分化的血液祖细胞中表达Lhx2基因[12]，获得了造血干细胞样的细胞系。然而，早期胚胎来源的造血干细胞，包括那些来源于胚胎干细胞体外分化的，移植于成体环境中由于未知的原因效率不高[13]。【本研究切入点】为获得具有移植于成年受体动物的能力的永生化血液祖细胞/干细胞，在来源于成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达Lhx2基因。这种策略产生了克隆化的并依赖于细胞因子的干细胞样细胞系[14]。由于造血干细胞本身并不表达Lhx2，在造血干细胞中异位表达Lhx2可能会改变这些细胞[15]，降低它们在体内的适应性。【拟解决的关键问题】为克服这一缺陷，我们拟采用Tet-On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline来诱导Lhx2基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得造血干细胞系[16]；而在这些永生化的造血干细胞移植前，撤销Doxycycline，终止Lhx2基因的表达。

1 材料与方法

1.1 实验动物

动物实验由西北民族大学实验动物伦理委员会审批。10～12周龄的C57BL/6小鼠由中国农科院兰州兽医研究所提供。

1.2 实验材料

质粒来自于美国Addgene；骨髓瘤细胞来自于ATCC公司(美国)；病毒包装细胞系GP+E-86来自ATCC公司(美国)；bone marrow-hematopoietic progenitor cell(BM-HPC) 细胞系来自于ATCC公司(美国)；BamH I酶和XhoI酶购自NEB公司(美国)； Doxycycline购自 Sigma 公司(美国)； 转 染 试 剂 Lipo-fectamine 2000 Reagent购自Invitrogen公司(美国)；5-氟尿嘧啶按150 mg/kg购自 Sigma 公司(美国)；IMDM培养基液、胎牛血清购自Gibco公司(美国)；0.15 mM的(monothiolglycerol)MTG购自 Sigma 公司(美国)；100 ng/mL 的stem cell factor(SCF)购自 Sigma 公司(美国)；10 ng/mL的anti-IL-6和1 %体积的anti-IL-3、4 μg/mL Polybrene来自Biolegend 公司(美国)； CD3ε购自 Sigma 公司(美国)；B220购自 Sigma 公司(美国)；TER-119购自 Sigma 公司(美国)；anti-CD11b购自 Sigma 公司(美国)；和anti-Gr-1购自 Sigma 公司(美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 质粒的构建与鉴定 用BamH I/XhoI双酶切从TtRMPVIR质粒上切下dsRed基因片段，并将带BamH I/XhoI黏性末端的Lhx2 cDNA连接入逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒，成功构建的质粒命名为VIR-Lhx2；dsRed基因的表达受四环素调节元件TREtight严格调控，载体组成型表达反式作用因子rtTA3，在Doxycycline的作用下发生构象变化，激活四环素调节元件TREtight，启动下游基因的表达；撤销Doxycycline，则下游基因的表达终止。

1.3.2 重组质粒转染 将VIR-Lhx2质粒转染逆转录病毒包装细胞系GP+E-86，获得条件性表达Lhx2基因的逆转录病毒；所述细胞系GP+E-86包含莫罗尼氏鼠白血病病毒Mo-MuLV的gag，pol和env区域。

1.3.3 骨髓培养 将10～12周龄的C57BL/6小鼠在获取骨髓3 d前用5-氟尿嘧啶按150 mg/kg处理，获取骨髓后在IMDM培养基中培养48 h，培养基中添加10 %胎牛血清，0.15 mM的MTG，100 ng/mL 的SF，10 ng/mL的IL-6和1 %体积的IL-3生成培养基；所述1 %体积的IL-3生成培养基由转染包含小鼠IL-3的载体的骨髓瘤细胞X63Ag8-653的条件培养基中获取。

1.3.4 流式分析 用含有4 μg/mL Polybrene的逆转录病毒上清液转导骨髓细胞，室温，转速2000 r/min离心90 min，将细胞转移至培养箱孵育6 h后，弃去含Polybrene的的逆转录病毒上清液，更换为添加有各种成分的IMDM培养基，培养48 h，用流式细胞仪分析Venus+的Lineage-Sca-1+c-kit+细胞，Lineage包含CD3ε，B220，TER-119，CD11b，和Gr-1；分选出的细胞培养于添加有各种成分的IMDM培养基，并添加1 μg/mL的Doxycycline；最后存活的细胞即为永生化的小鼠造血干细胞。

2 结果与分析

2.1 Lhx2基因的核苷酸序列

采用Tet-On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline以诱导Lhx2基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得造血干细胞系；Lhx2基因的核苷酸序列如图1所示。

2.2 逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒图谱

逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒的模式图如图2所示。dsRed基因的表达受四环素调节元件TREtight严格调控。该载体组成型表达反式作用因子rtTA3，在Doxycycline的作用下可发生构象变化，激活四环素调节元件TREtight，启动下游基因的表达；撤销Doxycycline，则下游基因的表达终止。用BamH I/XhoI双酶切从TtRMPVIR质粒上切下dsRed基因片段，并将带BamH I/XhoI黏性末端的Lhx2cDNA连接入该逆转录病毒载体，成功构建的质粒命名为VIR-Lhx2。将VIR-Lhx2质粒转染逆转录病毒包装细胞系GP+E-86(该细胞系包含莫罗尼氏鼠白血病病毒Mo-MuLV的gag，pol和env区域)，可获得条件性表达Lhx2基因的逆转录病毒。

图1 Lhx2基因的校苷酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of Lhx2 gene

2.3 工艺流程

如图3所示，将10～12周龄的C57BL/6小鼠在获取骨髓3 d前用5-氟尿嘧啶(5-FU)按150 mg/kg处理。获取骨髓后在Iscoves modified Dulbecco medium (IMDM)培养基中培养48 h，培养基中添加10 %胎牛血清(FCS)，0.15 mM monothiolglycerol(MTG)，100 ng/mL Steel factor(SF)，10 ng/mL interleukin-6(IL-6)和1 %体积的IL-3生成培养基(由转染包含小鼠IL-3的载体的骨髓瘤细胞X63Ag8-653的条件培养基中获取)。用含有4 μg/mL Polybrene的逆转录病毒上清液转导上述骨髓细胞，室温2000 r/min离心90 min。将细胞转移至培养箱孵育6 h后，弃去含Polybrene的的逆转录病毒上清液，更换为上述添加各种成分的IMDM培养基。培养48 h，用流式细胞仪分析Venus+的Lineage-Sca-1+c-kit+(LSK)细胞，Lineage包含CD3ε (145-2C11), B220(RA3-6B2), TER-119, CD11b (M1/70), and Gr-1 (RB6-8C5)。分选出的细胞培养于上述添加各种成分的IMDM培养基，并添加1μg/mL的Doxycycline。最后存活的细胞即为永生化的小鼠造血干细胞。

图2 逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒的图谱Fig.2 Map of retroviral vector TtRMPVIR plasmid

2.4 永生化的造血干细胞系与原代造血干细胞对比显示

将永生化的造血干细胞系(CD45.2+)与同系物小鼠的原代造血干细胞(CD45.1+)等比例混合作为供体细胞，尾静脉注射于经致死辐射处理过的受体小鼠中(CD45.1+CD45.2+)。8周后，检测骨髓中造血干细胞的来源，以及脾脏中不同来源的造血干细胞的分化情况。如图4所示，永生化的造血干细胞系和原代造血干细胞一样，能在受体小鼠骨髓中增殖，并在外周分化为T细胞、B细胞和髓系细胞。

图3 工艺流程 Fig.3 Flow chart

图4 永生化的造血干细胞系在骨髓嵌合小鼠模型中的增殖和分化情况Fig.4 The proliferation and differentiation of immortalized hematopoietic stem cell lines in a bone marrow chimeric mouse model

图5 永生化的造血干细胞系与原代造血干细胞的比较Fig.5 Comparison of immortalized hematopoietic stem cell lines with primary hematopoietic stem cells

如图5 所示，通过条件性表达Lhx2获得的永生化的造血干细胞系(图5右侧)和成年小鼠骨髓中的原代造血干细胞(图5左侧)相比，具有相似的表面标志物，从而证明Lineage-Sca-1+c-kit+，永生化的造血干细胞系极易扩增，可以获得大量均一的细胞群体。

3 结 论

Lhx2在成人造血祖细胞/干细胞中的表达可再现地产生通过类似物永生化的多潜能造血祖细胞/干细胞系。有研究表明BM-HPC细胞系对干细胞缺陷的原发性，继发性和三代受者小鼠中的成熟红细胞群体也显示出强烈的贡献，总共至少18个月的时间，揭示了自我更新和分化的显着潜力体内。当红细胞完全来源于细胞系时，受体可以存活，因为在某些情况下，接受移植的干细胞缺陷动物中100 %的循环红细胞为供体来源。这强烈表明BM-HPC系在体内产生功能性红细胞。但是与正常HSC相比，BM-HPC系在移植免疫受损小鼠方面效率较低。因为Lhx2很可能不在HSC中表达，HSC 中Lhx2的异位表达可能会改变这些细胞以降低其在体内的适应性。但是在研究结果可以看出Lhx2获得的永生化的造血干细胞系和成年小鼠骨髓中的原代造血干细胞相比，具有相似的表面标志物，从而证明Lineage-Sca-1+c-kit+，永生化的造血干细胞系极易扩增，可以获得大量均一的细胞群体。