莲雾花多酚的超声波辅助提取工艺优化抗氧化活性分析

林 波，郑凤锦，任 红，方晓纯，陈赶林

(1. 广西农业科学院农产品加工研究所，广西 南宁 530007；2. 广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西 南宁 530007；3. 三亚市南繁科学技术研究院，海南 三亚 572000；4. 广西农业科学院，广西 南宁 530007)

【研究意义】莲雾(Syzygiumsamarangense)，又名洋蒲桃、爪哇蒲桃等，属热带水果，在我国台湾、海南、福建、广东、广西、四川和云南等地均有种植[1]。莲雾花的膳食纤维、维生素C、氨基酸含量高，具有多种矿物质和功能性成分，在保健功效和药用价值上极具开发前景[2]。一般来说，5年生的莲雾树正常花穗有2000穗以上，每穗的花蕊数约有11～21个。在生产上，为达到提高果实产量和质量，约90 %的花会被人为疏掉，造成莲雾花资源的浪费[3]。莲雾花具特有的莲雾香，挥发性成分丰富，以萜烯类为主，并含有多种生物活性成分，可作花茶饮，汤色黄绿明亮。因此，挖掘莲雾花的功能性成分，对于开发新型营养产品，提高莲雾花的综合利用具有重要意义。【前人研究进展】植物多酚是指在植物体内由没食子酸或其聚合物的葡萄糖醇、黄烷醇及其衍生物的聚合物以及二者共同组成的植物多元酚[4]，目前已鉴定出8000多种酚类物质，按结构特征可分为类黄酮类、酚酸类、酚醇类、芪类和木酚素类[5]；具有抗氧化、抗菌消炎、降血糖血脂等功效[6]，是具多元酚结构的物质，广泛存在于植物体内花、根、皮、果实中[7-9]。邓俊琳等[10]研究发现绞股蓝的叶中总多酚含量高于茎中，醇提液的抗氧化活性也强于茎。孙洲悦等[11]研究表明辣木叶多酚对曲霉菌、毕赤酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有明显的抑制作用，对两种霉菌的抑制效果比对2种杆菌的抑制效果好。莲雾是集食用、药用、观赏、绿化等多功能价值的木本植物，其果、根、叶和皮都具有药用价值，据相关报道，目前，对莲雾的研究主要集中在果实采后贮藏保鲜[12-13]、果实营养成分分析及提取[14-16]、香气成分[3,17-18]等方面。【本研究切入点】莲雾果实中黄酮含量最高，其次是叶子，含量最低是花[2,16]但关于莲雾花中多酚化合物以及提取莲雾花多酚方法的相关研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】以莲雾干花为主要原料，进行以乙醇为溶剂，超声波辅助提取莲雾花中多酚，并对提取工艺进行响应面法优化，同时对莲雾花多酚提取液进行体外抗氧化能力进行分析，以期下一步对莲雾花多酚化合物功能活性深入研究，为开发多元化高附加值产品提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试莲雾花品种为黑珍珠(7年树龄)，于2017年3月26日采自三亚南鹿实业有限公司；主要试剂为：福林-酚、无水乙醇、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸等，均为分析纯；没食子酸、抗坏血酸等均为优级纯(国药集团化学试剂有限公司)。主要试验仪器及设备为：WND-200型高速中药粉碎机(浙江省兰溪市伟能达电器有限公司)、101-2AB型电热风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、JAC-300N型多功能超声波功率应用设备(山东省济宁市奥波超声电气设备有限公司)；ATX 224 电子分析天平(日本岛津公司)；GENESYS型紫外/可见扫描分光光度计[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]、SIGMA3K15型高速冷冻离心机(德国希格玛离心机有限公司)。

1.2 试验方法

将采摘后莲雾花鲜样于105 ℃ 下烘干、粉碎后保存备用，经测定，莲雾花干粉的水分含量7.65 %。莲雾花多酚提取工艺流程如下：莲雾干花→粉碎、过筛→精确称重→添加提取溶剂→超声波提取→离心过滤10 min(4000 r/min)→上清液→减压旋转蒸发(100 r/min、40 ℃浓缩30 min)→莲雾花多酚提取液

1.2.1 提取液浓度对莲雾花多酚得率的影响试验 在料液比1∶20 g/mL、提取时间1 h、提取温度50 ℃、超声波功率150 W的条件下，以不同体积分数的乙醇(45 %、55 %、65 %、75 %、85 %、95 %)为提取溶剂，考察提取液浓度对莲雾花多酚得率的影响。

1.2.2 提取时间对莲雾花多酚得率的影响试验 在料液比1∶20 g/mL、乙醇提取液浓度75 %、提取温度50 ℃、超声波功率150 W的条件下，以不同超声时间(0.5、1、2、3、4、5 h)提取，考察提取时间对莲雾花多酚得率的影响。

1.2.3 超声波功率对莲雾花多酚得率的影响试验 在料液比1∶20 g/mL、提取时间1 h、提取温度50 ℃、乙醇提取液浓度75 %的条件下，以不同超声波功率(120、150、180、210、240 W)提取，考察超声波功率对莲雾花多酚得率的影响。

1.2.4 提取温度对莲雾花多酚得率的影响试验 在料液比1∶20 g/mL、提取时间1 h、乙醇提取液浓度75 %、超声波功率150 W的条件下，以不同提取温度(40、50、60、70、80 ℃)提取，考察提取温度对莲雾花多酚得率的影响。

1.2.5 响应面法试验 根据Design-Expert 8.05b中Box-Benhnken实验设计原理采用3 因素3水平的响应面分析法，在单因素试验基础上，选取提取液浓度(%)、提取时间(h)、提取温度(℃)为自变量，莲雾花多酚得率为响应值，进一步优化确定超声波辅助提取莲雾花多酚的最佳工艺参数，验证后的多酚提取液进行体外抗氧化性分析(表1)。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 多酚标准曲线制作 参照文献[19]的方法，采用以没食子酸为标准物质的Folin-Ciocalteu法，以多酚质量浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，所得标准曲线的方程为：Y=0.0041x+0.0483，R2=0.9974。

1.3.2 莲雾花多酚得率的测定 取0.2 mL莲雾花多酚提取液加入试管中，分别加入0.8 mL去离子水、0.2 mL福林-酚试剂，振摇试管使样品充分混合，避光保存6 min后再加入7 % 碳酸钠溶液2 mL和去离子水1.6 mL，避光放置90 min，接着测定其在760 nm的吸光度值。多酚得率=(A-A0)×V×100 / (SLOPEstd×m×1000)，式中：A为样品测试液吸光度；A0为试剂空白液吸光度；SLOPEstd为没食子酸标准曲线的斜率；V为样品提取液体积(mL)；m为干粉质量(g)。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Response surface test factors level

1.3.3 羟基自由基(·OH)清除率的测定[20]吸取不同体积的莲雾多酚提取液于离心管中，用蒸馏水补足至2.0 mL后，依次加入2.0 mL 6 mmol/L硫酸亚铁溶液，2.0 mL 6 mmol/L过氧化氢溶液摇匀，静置10 min后，再加入2.0 mL 6 mmol/L水杨酸溶液，混合摇匀，静置30 min后置于510 nm波长处测其吸光值(Ai)。用蒸馏水替代水杨酸测得吸光值(Aj)。空白试验用蒸馏水替代不同体积试样，测得吸光值(A0)；同时以VC为对照。测定3次取平均值，计算清除率：

·OH清除率(%)= [1-(Ai-Aj)/A0]× 100

1.3.4 还原力的测定[20]吸取不同体积的莲雾多酚提取液于试管中，用蒸馏水补足至1 mL，加入2.5 mL的0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.6)及2.5 mL 铁氰化钾溶液(1 %)，50 ℃水浴20 min后急速冷却，加入2.5 mL三氯乙酸溶液(10 %)，于3000 r/min离心10 min。取上清液0.5 mL，加蒸馏水8.5 mL及1 mL 0.1 %三氯化铁溶液，混匀10 min后于700 nm处测定吸光度。吸光度值越大，说明还原能力越强。

图1 不同提取液浓度对莲雾花多酚得率的影响Fig.1 Effect of different extract concentrations on the polyphenols of Syzygium samarangense flowers

2 结果与分析

2.1 提取液浓度对莲雾花多酚得率的影响

由图1可知，随着提取液浓度的不断升高，莲雾花中多酚提取液的得率呈先升高后下降的趋势。提取液浓度为55 %时，莲雾花多酚得率最高，达到15.91 mg/g；当其浓度增大至95 %时，多酚的得率最低，仅为2.56 mg/g。这可能是由于乙醇作为提取液，乙醇的浓度越低，细胞渗透压越小，对多酚的提取影响较小；而提取液浓度过高，莲雾花中醇溶性的色素、亲脂性的化合物容易析出，以致影响莲雾花中多酚的提取，降低得率[21]。由此，莲雾花中多酚的提液浓度适宜为55 %。

2.2 提取时间对莲雾花多酚得率的影响

由图2得知，莲雾花的多酚随着提取时间的增加，多酚得率显著提高，在提取时间4 h时，多酚提取量最高；在提取时间超过4 h后，多酚提取量反而出现略微降低趋势。这是随着时间的延长，已溶出的多酚类物质会不稳定，易被氧化，且多酚的物质结构也易改变和受损，故多酚的提取量也开始下降[22]，因此，莲雾多酚提取的适宜提取时间为4 h。

2.3 超声波功率对莲雾花多酚得率的影响

由图3可知，莲雾花多酚得率随着功率的升高而逐渐增加。当超声波功率为210 W时，莲雾花多酚的提取量达到最高值15.52 mg/g，功率180 W的提取量次之，为15.39 mg/g，功率240 W的最少；当超声波功率大于210 W时，莲雾花的多酚得率呈明显下降趋势。这可能是功率增大时，超声波产生的强烈振动会引起细胞内部结构的变化及细胞壁的破坏，加快扩散和溶解速度，这与娄在祥的研究结果相似[23]。综合考虑提取效果和设备的损耗，超声波辅助提取莲雾花中多酚的最适功率为180 W。

图2 不同提取时间对莲雾花多酚得率的影响Fig.2 Effect of different extraction time on the polyphenols of Syzygium samarangense flowers

图3 不同提取功率对莲雾花多酚得率的影响Fig.3 Effect of different ultrasonic power on the polyphenols of Syzygium samarangense flowers

2.4 提取温度对莲雾花多酚得率的影响

由图4可知，不同提取温度对莲雾花多酚得率的影响差异明显，随着提取温度的升高，莲雾花中多酚的提取量呈现递增趋势。在超声温度60 ℃时，莲雾花多酚的提取量最高；当超过温度60 ℃后，多酚的提取量反而呈现降低趋势。这是因为随着温度的不断升高，莲雾花中可溶性物质的氢键容易断裂，加快了多酚物质的渗透性、溶解性和扩散速度，从而提高了多酚的提取量；而当提取温度超过最适温度后，多酚化合物物质在较高温度下趋于不稳定，容易被氧化，还可能导致多酚的物质结构被破坏，使其多酚化合物提取量下降[24]，这与王敏等[25]对板栗壳多酚提取工艺研究中，提取温度对得率的研究结果一致。因此，超声波辅助提取莲雾花多酚的最适提取温度为60 ℃。

图4 不同提取温度对莲雾花多酚得率的影响Fig.4 Effect of different extraction temperature on the polyphenols of Syzygium samarangense flowers

表2 响应值实验设计及结果Table 2 Response value experiment design and results

表3 二次响应面回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic response surface regression model

注: * 代表显著(P<0.05)；**表示极显著(P<0.01)。
Note: * indicated significate difference (P<0.05); ** indicated highly significate difference (P<0.01).

2.5 响应面试验设计及结果

根据中心组合试验设计原理，结合单因素试验结果，由于超声波功率对莲雾花多酚得率影响较小，故在使用响应面优化工艺时，选取提取液浓度、提取时间、提取温度作为工艺优化的因素，以提取量为响应值(表2)。

根据中心组合试验结果，以多酚提出率为响应值，运用Design-Expert 8.05b软件进行分析处理(表3)，并得多元二次回归方程：

Y=12.67-2.35×A+0.51×B+0.36×C-0.049×AB+0.26AC+1.0BC+0.32A2+0.028B2-0.86C2。

2.6 响应面图形分析及工艺优化

从图5可知，提取液浓度和提取时间对莲雾花多酚提取量的影响显著，随着提取液浓度和提取时间的增加，多酚提取量呈先升高后降低的趋势，因此，在提取多酚工艺时，选择合适的提取液浓度和时间可以提高多酚的提取量；如图5-b所示，随着提取温度的升高和提取液浓度的增大，提取量开始下降。整体来看，提取液浓度对多酚提取量的影响要大于提取温度。可见在实际提取工艺时，应选最适的提取液浓度并适当控制提取温度在最适范围。由图5-c可见，多酚提取量随着提取时间的增加和提取温度的升高呈现缓慢增大后下降的变化，在提取时间4 h和提取温度60 ℃时，莲雾多酚提取量达到最大值。因此，适当提高提取时间和提取温度有利于多酚提取。

2.7 莲雾花多酚提取工艺的优化及验证结果

利用Design-Expert 8.05b软件对试验数据优化预测，进一步确定提取条件工艺最佳条件，得到多酚的提取优化最佳条件是提取液浓度55 %、提取时间5 h、提取温度60.63 ℃，预测得到莲雾花多酚提取量为16.366 mg/g。为检验该响应面优化方法的可靠性，采用上述最适宜工艺条件进行超声波辅助提取莲雾花多酚的验证试验，同时为了实际操作的方便，将最适宜条件修正为提取液浓度55 %、提取时间5 h、提取温度60 ℃，在固液比1∶20、超声波功率180 W的条件下，实际测得的多酚提取量为16.51 mg/g，与理论预测值符合度较高，因此，采用响应面优化莲雾花多酚的提取工艺条件参数准确可靠，证实了该方程的准确性和实用性。

图5 各因素交互作用对莲雾花多酚提取量影响的响应面Fig.5 Response surface of interactive effects for every various factors on acid amount

2.8 莲雾花多酚的体外抗氧化性分析

按照响应面设计优化出的工艺条件提取出的莲雾花多酚，将莲雾花多酚提取液按一定比例稀释20、100倍，以1 mmol/L的Vc浓度稀释20倍作对照，配成不同体积浓度的样液进行体外抗氧化性研究，结合图6和图7结果可以看出，随着添加提取液体积增加清除作用逐步增强，多酚提取液对·OH的清除能力和还原能力这两项指标都略高于同体积同浓度的Vc，这表明多酚提取液在体外具有抗氧化性。

3 讨 论

多酚是具有一个或几个苯环并结合多个羟基分子结构的化合物总称，不仅是植物体内重要的代谢产物，还是植物感官、风味、营养品质的影响因素[26]。植物多酚成分复杂、化学结构稳定性差，目前还没有标准化的提取方法。常用的提取方法主要是加热、回流提取，溶剂萃取，超声波辅助、超临界流体萃取、微波浸提、生物技术等[27]。这些方法各有优缺点，如加热、回流提取方法温度过高导致多酚易氧化分解、得率低，且试剂使用量多；超临界流体萃取、微波浸提具有提取物品质好且得率高，但生产设备昂贵，成本较高。生物技术提取方法工艺简单便捷、能源损耗低，但由于纯度低、耗时长，不适于工业生产。而超声波辅助提取方法提取温度低、得率高且省时、成本低廉，成为日本提取植物多酚成分的主流提取方法[28]。林枞雨等[29]研究表明超声波辅助提取甜玉米多酚，明显优于乙醇浸提法和微波提取法，提取率高达约96 %。蒋丽等[30]研究不同提取方法对茶多酚理化性质评价，发现超声波提取茶多酚的提取率高，相对于热回流、酶法、纤维素酶协同超声波法所得产品，该法产品纯度、抗氧化活性优势更明显。本研究采用超声波辅助提取莲雾花中多酚化合物，结果表明，在单因素试验结果结合提取效果、实际生产和设备的损耗等各方面考虑，得到单因素最适条件；再此基础上，利用响应面试验对提取工艺进行优化，得到超声波辅助提取优化工艺，同时进行优化工艺的实际验证，与理论预测值相差不大。

图6 莲雾花多酚浓度和Vc羟基自由基清除率的关系Fig.6 Relationship between the syzygium samarangense flowers and Vc hydroxyl radical scavenging rate

莲雾花具有较强的抗氧化性，主要是多酚化合物含有多个羟酚基，其抗氧化性与其结构特性有着密切的关系[31]。多酚化合物在抗氧化反应中直接清除或阻断自由基链反应，或与产生自由基相关的酶之间的相互作用，络合诱导氧化的过量金属离子，从而间接清除自由基[32]。经大量研究表明，羟基自由基是一类对机体生物有较强破坏力的且很活跃的自由基[33]；还原力是基于Fe3+向Fe2+转换的原理来判断化合物抗氧化性的一个重要指标[19]。本研究对优化工艺后的多酚提取液进行体外抗氧化性分析，结果显示，对比同体积同浓度的Vc，随着体积的增加，提取液对·OH的清除能力逐渐明显高于Vc；在对还原力的比较中，提取液的吸光值也在不断升高，且都比Vc的还原力强，都说明其抗氧化能力随着多酚提取液浓度的增加而提高，这与相关研究报道结果一致[32]，具有较强的体外抗氧化性。由此可见，莲雾花具有较好的营养功效，合理开发利用莲雾花的功能活性，可提高莲雾副产物的综合利用价值。

图7 莲雾花多酚浓度和Vc的还原能力Fig.7 The syzygium samarangense flowers of polyphenol concentration and Vc reduction ability

4 结 论

响应面试验优化超声提取莲雾花多酚的工艺，超声波辅助提取莲雾花多酚在固液比1∶20、超声波功率180 W条件下，最佳提取工艺条件为提取液浓度55 %、提取时间5 h、提取温度60 ℃，实验测得的多酚提取量为16.51 mg/g。莲雾花多酚提取液在一定的浓度内，对·OH的清除能力和还原能力具有较强的体外抗氧化活性，为进一步研究莲雾花提供数据参考。