基于银耳转录组测序的多糖代谢途径分析

王 东，牛 蓓，宋 君，赵树海，雷绍荣，郭灵安，张富丽，刘文娟，常丽娟，赵黎明

(1．四川省农业科学院分析测试中心，四川 成都 610066；2.成都大学医学院，四川 成都 610106；3.巴中市通江银耳科学技术研究所，四川 通江 636700；4.四川省农业科学院，四川 成都 610066)

【研究意义】银耳(Tremellafuciformis)又称白木耳、雪耳，为担子菌门银耳属中温好气性真菌，是我国传统药食兼用真菌[1]。人们通常所称的银耳实为银耳的子实体，由银耳菌丝和香灰菌共生发育而来，为白色或略带黄色，胶质半透明。中医认为银耳性平，在《神农本草经》、《本草纲目》等经典专著中均有记载，具有补肾、润肺、生津、止咳的功效。银耳在我国分布较为广泛，已有几百年的栽培史，其中以四川通江和福建古田两地最为著名[2]。作为重要的药食真菌，优良银耳菌株的选育成为支撑银耳产业健康发展的重要内容。但在实际生产中，银耳品种老化、退化等现象十分严重，严重影响了银耳品质的提升[3]。因此，为提高银耳品质，有必要对其有效成分的合成途径及调控机制进行研究，以此来指导银耳品种培育和科学生产。【前人研究进展】银耳营养丰富，含有多种人体必需氨基酸，以及钙、铁等多种矿物质。现代研究表明，银耳的主要活性成分是以α-(1→3)-D-甘露糖为主链的杂多糖，其具有抗辐射、抗氧化、提高人体免疫功能、延缓衰老，抑制肿瘤等多种作用[4-6]。根据单糖的种类不同，多糖可分为同型多糖和异型多糖[7]。典型的多糖合成基因簇一般包括糖核苷酸合成相关基因、糖基转移酶基因和多糖合成调节基因[8]。尽管各种多糖的具体结构不同，但共同的特点是都由常见的单糖重复单元组成，不同微生物细胞体系中多糖合成代谢的基本途径十分相似。作为影响银耳品质的关键成分，目前大量研究集中在多糖的结构、药理及其分离纯化技术方面，而对银耳多糖在分子水平上的合成机制报道甚少。针对银耳的分子生物学研究主要集中在遗传转化、基因克隆、分子标记等方面，而在基因组学方面的研究很少[9]。因此，弄清银耳多糖合成机制将对银耳品质生产提供理论依据，也将为进一步挖掘其它多糖合成途径及关键基因提供了参考依据。【本研究切入点】本研究以四川和福建两种银耳菌丝体为研究材料，运用Illumina测序技术进行银耳菌丝体转录组测序分析，对unigene序列进行注释，全面分析了银耳转录组测序数据。【拟解决的关键问题】本研究将为银耳分子标记开发和重要性状的功能基因克隆等提供数据，也将为银耳品质遗传工程改良和育种等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究材料

银耳菌株T1(四川通江银耳)和F3(福建古田银耳)收集自四川省农业科学研究院土壤肥料研究所，经分离和纯化后获得菌丝体，对菌丝体进行培养后收集，每个菌株培养3份。

1.2 转录组文库构建

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)对6个样品进行总RNA提取，经Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)进行质检合格后。将质检合格的总RNA按照菌株进行合并，获得2个测序样本，并对总RNA进行纯化。按照Illumina上机测序要求，对纯化后的Total RNA进行系列操作，包括mRNA的分离或rRNA去除、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成、末端修复、3’末端加A、连接接头、富集等步骤。使用Qubit®2.0 Fluorometer 检测浓度对所建文库进行浓度测定。

1.3 转录组测序及处理

按照HiSeq 2500高通量测序平台操作流程对银耳样品转录组文库进行测序，获得进行双端测序结果，将获得的序列进行可信度分析和质量评估。剔除低质量序列(N 的比例大于5 %，20 %以上为Q≤10 的序列)和接头(adaptor)序列，获得clean reads。通过Trinity进行序列组装，获得unigenes作为后续分析序列。

1.4 测序数据注释

将得到的unigene序列运用Blastx与Uniprot数据库进行对比，筛选条件为E-value<1E-5。unigene与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG和KEGG 数据库比对，获得unigene 功能注释信息。根据银耳转录组unigene序列的KEGG注释信息，对注释信息进行整理，分析银耳多糖生物合成途径，并对涉及相关unigene及对比信息进行分析。

2 结果与分析

2.1 银耳转录组测序数据

对2个银耳样本进行测序文库构建，使用Qubit®2.0 Fluorometer 检测浓度分别达到5.18和6.54 ng/μl，Agilent 2100检测结果表明主峰长度分别为469和466 bp，表明构建的银耳测序文库质量合格，满足上机测序要求。

使用Illumina HiSeq 2500 高通量测序平台对每个样品进行测序，数据预处理组装后共得到17 008条unigene，总长度为24 663 446 bp。Unigene平均长度为1450 bp，最小长度为281 bp，最大长度为16 768 bp，GC含量为57.80 %。通过组装序列长度分布可知(图 1)，400～600 bp范围分布的序列最多，数目为3126(18.38 %)；超过2 k的序列中，主要分布在2000～3000 bp，数目为2102(12.36 %)，并随着长度增加而数量逐渐减少。本研究中测序得到的银耳转录组数据N50达到2073，表明本研究中构建的银耳转录组数据库质量较高。

2.2 银耳转录组数据功能注释

基于UniProt数据库，对获得的银耳转录组unigene序列进行对比和注释，13 006条序列注释到已知数据库中，占总序列的76.47 %。其中较强同源性(<1×10-45)的序列比例为67.52 %，中度同源性(1×10-5～1×10-45)的序列比例为32.48 %；相似度介于22.27 %～100 %，其中55.05 %的相似度大于60 %，表明测序结果与已知序列相似度较高。

基于COG分类注释结果表明，10 152条unigene能够注释到COG数据库中，涉及25种COG分类，其中注释最多的5个分类为“Intracellular trafficking, secretion, vesicular transport”、“Signal transduction mechanisms”、“Cytoskeleton”、“General function prediction only”和“RNA processing and modification”。基于GO数据库将unigene按照分子功能(molecular function)、细胞位置(cellular component)、生物过程(biological process)进行分类(图 2)，4781条unigene得到注释，涉及分子功能序列4705条、细胞位置序列1971条、生物过程序列1173条，表明银耳转录组序列中更多涉及分子功能。

图1 组装序列长度分布Fig.1 Unigene length distribution

2.3 银耳转录组数据KEGG分析

基于KEGG数据库，对银耳转录组数据进行分析，表明5671条序列获得KEGG注释，共映射到297条途径。涉及unigene数目最多的五个途径分别为：Metabolic pathways、Biosynthesis of secondary metabolites、Biosynthesis of antibiotics、Microbial metabolism in diverse environments、Biosynthesis of amino acids，对应unigene数目为1442、650、486、407和257 (表 1)。

2.4 银耳多糖合成途径相关基因鉴定

研究表明银耳多糖是银耳的主要活性成分，是银耳菌丝体生命活动的基本物质之一。银耳多糖种类较多，大多数以甘露糖为主链。根据转录组数据，对果糖和甘露糖代谢通路进行分析，其代谢途径如图3所示，共挖掘得到74条unigene序列，涉及21个酶(表 2)。其中，编码L-iditol 2-dehydrogenase涉及的unigene数目最多，为15条；其次是编码butanol dehydrogenase的unigene为10条；编码phosphomannomutase、triosephosphate isomerase和fructose-2,6-bisphosphatase等7个酶涉及1个unigene。对银耳果糖和甘露糖代谢途径的研究，将有助于进一步研究银耳活性成分的形成机理。

图2 转录组序列分类GO柱Fig.2 Histogram of GO classification of all unigenes

图3 银耳果糖和甘露糖代谢途径Fig.3 The fructose and mannose metabolism pathway in Tremella fuciformis

表2 果糖和甘露糖代谢途径相关的unigeneTable 2 Unigenes related to fructose and mannose metabolism pathway

3 讨 论

随着测序技术的发展，基因组学和转录组学等研究进入了全新的时代。转录组测序促进了非模式物种及无参考基因组物种的分子生物学研究。转录组测序(RNA-seq)是利用高通量测序技术进行的转录组分析的一种技术，其具有高灵敏度、重复性好和数字化等多种优势[10]。随着转录组测序技术的发展和配套分析软件的不断成熟，加之无需参考基因组数据，使得转录组测序得到广泛使用[11-12]。对于短时间内无法完成基因组测序的生物而言，转录组测序技术极大地促进了分子生物学的研究，为后续挖掘奠定了理论基础。 在食用菌方面，转录组测序已经应用于食用菌发育相关基因挖掘，活性物质的调控解析，以及分子标记开发等方面。Huang等[13]对桑黄(Phellinuslinteus)的菌丝体进行转录组测序，组装后获得25 811个Unigene，并对与桑黄甾醇的生物合成相关基因和SSR分子标记等进行挖掘；Shu等[14]对茯苓(Wolfiporiacocos)的菌丝体和菌核分别进行转录组测序分析，基于获得unigene序列进行萜类代谢途径解析，发现在茯苓中萜类化合物的生物合成只能通过MVA途径。Lu等[15]对牛樟芝(Antrodiacinnamomea)进行基因组和转录组进行测序分析，并对菌丝体和子实体差异表达基因等进行分析，挖掘得到了萜类生物合成等关键产物的代谢途径。聂文强等[16]对药食两用真菌灰树花(Grifolafrondosa)进行转录组测序分析，挖掘得到了115条unigene与多糖合成相关，以及1155个SSR位点，为灰树花及同属物种的遗传图谱构建和功能基因挖掘奠定了基础。Tang等[17]对香菇转录组和蛋白组进行分析，研究了光诱导对香菇菌丝转色的形成机制，揭示出与香菇菌丝转色的候选基因，并初步建立了其分子模型。转录组测序已经广泛应用于食用菌代谢通路和关键调控基因解析，并促进了分子标记开发和遗传图谱构建。基于上述研究，本文以银耳为研究对象，运用转录组测序技术，对银耳转录组文库进行构建和分析。

本研究运用Illumina测序平台对银耳菌丝体转录组进行测序分析，组装得到17 008条unigene序列。与其它食用菌相比，银耳转录组测序得到序列数量多于白蚁蘑菇、双孢蘑菇等[18]，少于灵芝、桑黄和茯苓等食用菌[13]，这可能与物种本身特性和取材等因素有关。对于unigene长度而言，本研究得到unigene的平均长度和N50值为1450和 2073 bp，远高于灵芝、桑黄、白蚁蘑菇和茯苓等，表明银耳转录组测序结果质量较高，为深入开展银耳品质形成机理提供了丰富的数据资源。基于银耳转录组测序数据，对果糖和甘露糖代谢途径相关基因，分析得到74条unigene，编码21个酶；其中编码L-iditol 2-dehydrogenase的unigene最多，其次是butanol dehydrogenase。与其他物种转录组数据分析相比，银耳转录组数据中挖掘得到的果糖和甘露糖代谢相关基因较少；但涉及果糖和甘露糖代谢的酶数目与其他研究基本一致。上述结果表明，银耳中果糖和甘露糖代谢途径的调控过程涉及常见酶，调控过程相对复杂[19]。利用转录组测序技术对银耳进行测序分析，获得大量转录本信息，从分子机制水平上揭示关键成分的分子机制，将有助于银耳品种培育和生长调节，促进银耳产量和品质。

4 结 论

本研究采用Illumina测序平台对银耳菌丝体进行转录组测序，得到大量的转录组序列信息，并对序列进行了生物信息学分析和数据解析。从银耳菌丝体转录组数据中共得到了17 008条unigene序列，其中N50为2073 bp。其中，76.47 %序列能够注释到Uniprot公共数据库；共有74条unigene序列涉及银耳果糖和甘露糖代谢途径。对银耳转录组进行测序和分析，有助于深入开展银耳多糖合成机理和品质提升研究，为进一步提升银耳品质和产量奠定了理论基础。银耳形成复杂，涉及与香灰菌的互作，其互作过程对银耳多糖形成机理仍有待深入研究。