前额叶皮层CaMKII活性对大鼠海洛因自身给药戒断后复吸的影响

张逸之，陈盛强，2*

(1.广州医科大学附属第二医院; 2.广州医科大学神经科学研究所， 广东 广州 510260)

阿片类药物成瘾已经成为一个全球性的问题，目前全世界有1 300～2 500万人正遭受阿片类物质成瘾的折磨，其中亚洲人约占总人数的50%[1]。相对于吗啡等其他阿片类药物，海洛因能更迅速地通过血脑屏障与相应位点结合，具有更强的成瘾性[2]。目前，在世界范围内，包括海洛因成瘾药物主要的治疗重点与难点在于控制戒断后的复吸[3]，而药物相关线索及药物本身的奖赏效应是诱发海洛因患者复吸的重要因素。患者在使用成瘾药物的同时，形成了用药环境和用药工具这些线索与成瘾药物奖赏之间的关联性学习记忆，这种记忆即使在患者戒断相当长时间后依然存在，当患者再次回到用药环境或接触到用药工具后，很容易诱发复吸的产生。使用药物之后的奖赏效应，再次强化了患者对药物的渴求，从而使患者陷入“吸毒—戒毒—再吸毒(复吸)”的恶性循环中。近年来，各国医生及科研工作者对成瘾、戒断、复吸等现象及其机制与治疗方法都进行了深入的研究与探索。有研究证实，内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex，mPFC)也参与了药物成瘾有关的学习与记忆过程[4-6]。大量研究证明，长时程增强(long-term potentiation， LTP)的形成需要NMDAR的参与，而LTP又是改变神经可塑性的一个重要因素，因此NMDAR与其下游的CaMKII被认为与中枢神经系统的学习和记忆功能有着密切的关系[7-9]。CN21是一种特异性较强的CaMKII抑制剂[2-3]，其通过与CaMKII T位点的结合，解断CaMKII与NMDAR的物理链接，进而抑制CaMKII活性。本研究通过脑区微注射CN21，解断mPFC中NMDAR与CaMKII的物理链接，以观察其对于海洛因成瘾大鼠复吸的影响。

1 材料与方法

1.1 实验药物

海洛因由公安部物证鉴定中心提供并鉴定，LV-CN21由长沙赢润生物技术有限公司提供。

1.2 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量240～300 g，自由饮水，进食。动物分笼饲养于昼夜节律12/12 h(7am—7pm)通风良好的动物房。环境温度控制在22℃～24℃，湿度50%～70%。每天8：00至17：00点进行实验，颈静脉插管手术开始前，大鼠熟悉环境1周，实验者每天接触大鼠15 in以使其熟悉实验者及操作以减少应激。

1.3 实验方法

1.3.1自身给药训练 将静脉置管的大鼠放入实验笼中，连接大鼠静脉置管与训练笼的输液系统，训练期间禁食、禁水。训练选用固定比率(FR1)强化程序，海洛因训练每天4 h，每天固定时间训练1次，持续14 d。训练结束后，大鼠放回饲养笼内，予约20 g饲料，不限饮水。当大鼠注射数连续3 d达到稳定数量(一般超过10次注射)，且波动<15%，视为反应稳定。

1.3.2条件线索及环境线索的消退与药物皮下注射诱导的觅药行为的恢复 所有自身给药训练成功的大鼠在训练结束后，进行核团微注射给药并放置于饲养笼进行自然戒断。在14 d的自然戒断后，放回自身给药训练箱。启动程序后，在满足有效鼻触的条件下，笼内出现与自身给药训练时相同的各项条件线索，但没有药物的静脉注射，与训练时相同，无效鼻触只在计算机中记录而不会有任何线索及给药。计算机记录有效鼻触和无效鼻触的次数，整个实验进行时间与训练时间相同(海洛因4 h)。

1.3.3条件线索及环境线索的消退与药物皮下注射诱导的觅药行为的恢复 在所有大鼠完成条件线索及环境线索诱导的复吸实验后，再按照该实验步骤每天进行与自身给药训练相同时间的消退。目的是建立起动物对训练笼环境以及鼻触灯等条件新的认识，即鼻触没有药物奖赏。在进行约14 d后，每次消退训练动物有效鼻触与无效鼻触相差小于10次即可判断为消退成功。将消退成功的动物皮下注射训练时的药物(海洛因 100 μg)，至于训练箱中。训练程序只记录动物鼻触次数，左右鼻触均不会出现任何条件性线索。在分别进行4 h测试后记录动物鼻触次数。

1.3.4立体定位、核团微注射给药 核团微注射于大鼠自身给药训练后进行，大鼠麻醉后，根据Paxinos和Watson(1998)大鼠脑立体定位图谱，定位mPFC(AP 5.2 mm ML ± 0.6 mm DV 8.0 mm)，用牙科钻于颅骨钻孔后插入微注射针，给药时用微量注射器以每分钟0.5μL的速度将LV-CN21或溶媒注射到目的脑区，每次注射时间为1 min，注射后留针1 min，待药物充分核团进入不会顺注射孔回流后缓慢出针，将头皮缝合消毒。术后3天大鼠每天予20万U青霉素静脉注射，按照常规单笼饲养。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 海洛因自身给药实验结果

从图1可见，大鼠海洛因自身给药训练过程中，前5天大鼠有效鼻触呈明显上升趋势，并在之后的训练中一直保持在30～35次，而无效鼻触从训练开始一直处于一个较低的水平。在训练期间有效鼻触远大于无效鼻触，且在训练后期每个训练周期有效鼻触差异数<10%提示海洛因自身给药模型稳定，符合实验要求。

模型建立后，动物放回饲养笼饲养，没有任何海洛因及成瘾模型建立时存在的各种条件线索的刺激，模拟了人类在被动戒毒的过程。而在第25天的环境及条件线索诱导的复吸之后，动物放回原来的训练环境，有效鼻触给予同样的条件线索但没有任何海洛因奖赏，是让动物重新习得在训练时的各种条件刺激不伴随药物奖赏。在整个消退过程中，动物有效鼻触次数随着训练次数的增多逐渐向无效鼻触次数靠近，说明大鼠已经建立起新的鼻触—不伴海洛因奖赏的联系。为进一步观察海洛因皮下注射诱导的觅药行为的恢复排除了条件刺激与环境刺激的干扰。

1020300trainingdaysabstinence(12days)activeinactive6040200heroinSA,abstinenceandextinctionactivepoking

图1 海洛因自身给药实验结果

2.2 mPFC注射CN21可抑制海洛因成瘾大鼠环境与条件线索联合诱导的复吸

将大鼠海洛因自身给药训练的后3天有效鼻触的平均值作为大鼠自身给药的训练状况，将建模成功的模型鼠随机分为两组，分别在mPFC核团注射LV-CN21(实验组)及LV-GFP(对照组)。如图2所示，戒断12 d后放回训练箱，在原有环境及训练时各种条件的刺激下，大鼠即使没有海洛因的奖赏效应也会反复触碰有效鼻触孔，提示环境与条件线索诱导的复吸模型建立成功(灰色柱状图)。而在mPFC注射LV-CN21后大鼠的有效鼻触较对照组(LV-CN21)明显降低(P<0.05)，提示在mPFC注射CN21能有效抑制海洛因成瘾大鼠对条件及环境线索诱导的复吸。

LV-CN21LV-GFP1209060300*SAtrainingcue/contextreinstatementactivepoking

图2 两组海洛因成瘾大鼠环境与条件线索
联合诱导的复吸情况比较

2.3 mPFC注射CN21可抑制海洛因成瘾大鼠海洛因皮下注射诱导的复吸

如图3所示，在经过14 d的消退训练后，实验组和对照组皮下注射相同计量海洛因，注射完10 min后再次放入训练箱观察。在海洛因本身的奖赏作用下，对照组大鼠再次出现反复触碰有效鼻触孔的觅药行为(灰色柱状图)。而实验组动物的有效鼻触次数则明显受到抑制(P<0.05)。

*heroinprimingSAtraining1209060300activepokingLV-CN21LV-GFP

图3 两组海洛因成瘾大鼠皮下注射海洛因
诱导的复吸情况比较

3 讨 论

本研究通过使用自身给药技术建立了大鼠海洛因的复吸模型，用于研究CN21在环境和条件联合诱导及药物诱导的复吸中的影响。该模型模拟了人类经典的药物滥用在戒断之后的复吸行为，即吸毒、戒毒、再次看到原来环境及吸毒是各项线索而产生的复吸，而与其对应的实验戒断分别为：自身给药、戒断、复吸实验。在已知的诸多诱发复吸的因素中环境先和条件线索是最为重要的因素，而一旦有了第一次复吸，药物注射引发的奖赏效应，更加强化了觅药冲动，直接导致了患者在戒毒之后的复吸较未戒毒是更容易因用药过量而死亡。与其他报道模型不同，本研究将消退训练改为在离开给药时的环境，更加贴切的模拟了人类离开原来吸毒环境到戒毒所治疗，回到生活中因为看到注射器等吸毒的线索或回到吸毒时所存在环境而产生复吸的现象。在线索与环境联合诱导的复习后又通过消退实验排除这些导致复吸的因素，从而可以更直观明确地观察药物奖赏诱导的复吸。

在mPFC中表达CN21后，能有效抑制海洛因成瘾大鼠线索—环境联合诱导及药物奖赏诱导的复吸，其机制可能是CN21干扰了大鼠原有的条件—奖赏记忆，即在训练后表达CN21将大鼠在自身给药训练时形成的条件—奖赏的关联打断，因而即使动物在回到之前训练时的环境，接受训练时伴随给药的各项刺激均未能使其回忆起当时获得药物的方法。因为在复吸期间没有任何药物奖赏而阻止了大鼠再次习得鼻触有效孔-获得海洛因这个对应关系。而在药物引燃的复吸实验中，虽然动物获得药物的奖赏，但未能充分唤起其在训练时建立起来的联系，从而抑制其有效鼻触次数。

近年来，成瘾研究的方向由原来的对奖赏效应的探索慢慢向学习记忆方向转变，而有越来越多的研究开始着眼于不同类型成瘾物质的形成及复吸机制的探索[3-4]。本研究结果证实，在海洛因大鼠自身给药模型中，mPFC中CaMKII活性对复吸的抑制作用为海洛因成瘾的治疗提供了一个新的药物及作用靶点。