中华绒螯蟹金属硫蛋白基因在A549细胞中的表达及鉴定

邓小亮，钟秋珍，付欣,洪玮，谭茵，马文康

(广州医科大学生命科学学院，广东 广州 511436)

金属硫蛋白( metallothionein，MT) 是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质[1]，由哈佛大学的Margoshes等[2]于1957年首次从马肾中分离得到并命名。MT具有多种重要的生理功能，其作用之一是能结合Cd、Cu、Zn等多种金属离子[3]，通过结合/释放重金属离子，调节机体必需重金属的稳态及对有害重金属进行解毒，并起氧化应激防护作用。MT又受重金属离子的诱导表达，当环境中的某些重金属离子浓度升高时候，MT表达量随之一定范围内增加。蟹类生活在水体的基底层，当水体被重金属污染时首当其冲， MT可能是其抵抗重金属毒性的重要生理机制之一，但关于蟹类MT 的研究较为少见。因此，深入研究蟹类MT的功能对于物种保护、重金属污染防治及药物开发等方面具有重大意义。本实验将中华绒螯蟹MT基因的编码序列克隆至真核表达载体pEGFP-C1上，转染A549细胞，融合表达绿色荧光蛋白GFP和MT，获得的MT蛋白为进一步深入研究其结构和功能打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1载体与细胞 含有中华绒螯蟹MT基因编码序列的质粒PET15b-MT由本实验室前期构建保存，真核表达载体pEGFP-C1 (clontech)，A549细胞，大肠杆菌感受态DH5α皆由本实验室保存。PMD-19T(simple)载体购自大连宝生物有限公司。

1.1.2主要试剂 质粒提取、核酸凝胶回收试剂盒购自上海生工。DL2000，DL15000 DNA Marker，rTaq PCR试剂盒,连接酶solutionⅠ购自大连宝生物有限公司。限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ购自北京NEB有限公司。DMEN培养液、小牛血清购自Gibco；脂质体Lipofectamine 2000、蛋白marker购自thermo Fisher。ECL显色试剂盒(Beyotime)，小鼠来源一抗anti-GFP(santa Cruz)，HRP标记的兔抗小鼠二抗(abcam),兔源anti- a tubulin 一抗(abcam),HRP标记的羊抗兔二抗(abcam)

1.2 方法

1.2.1构建表达载体 根据NCBI上公布的中华绒螯蟹MT序列(登录号AY057396.1)设计MT基因特异性引物，利用质粒PET15b-MT作为模板，rTaq酶做PCR反应扩增得到MT基因编码序列。采用真核表达载体pEGFP-C1的原有阅读框，选择多克隆位点处的EcoRⅠ、BamHⅠ两个酶切位点插入MT基因的编码序列，使得MT基因和GFP基因融合表达。基于上述方法要求，设计引物时在上游引物MT f和下游引物MT r 5’端分别加入了EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点和保护碱基。引物序列分别为MT f:CCGGAATTCCATGCCTGACCCTTGCTGTAACG;MT r:CGCGGATCCTTACTAGGGGCAGCAGGAGCAAGGC

按照说明书配置50微升PCR反应体系，反应条件为94 ℃预变性3 min，98 ℃变性10 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环，72 ℃10 min，4 ℃保藏。 PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(电压120伏，20 min)，若有符合大小的目标条带，则用胶回收试剂盒割胶回收，定量。回收后的PCR产物做EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切2 h，载体pEGFP-C1也做同样处理。酶切完成后对pEGFP-C1进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并割胶回收，定量。将酶切后的PCR产物和pEGFP-C1按照连接酶试剂说明书混合，加入连接酶solution Ⅰ，16 ℃连接2 h。转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养过夜。挑选单克隆菌落做PCR,阳性者接种于LB培养液(加入氨苄青霉素)震荡培养过夜，提质粒，做双酶切鉴定。双酶切阳性者再送样到生工生物工程(上海)有限公司测序鉴定，测序正确的质粒命名为pEGFP-MT。

1.2.2pEGFP-MT转染A549细胞 转染前一天，将细胞种植于24孔细胞培养板中，用不添加抗生素的DMEN培养液于细胞培养箱中培养细胞，至细胞密度为70-80%时(一般24 h后)开始转染实验。同时做空载体转染和细胞纯培养对照。取出细胞孔板，弃培养液，用D-hanks液洗涤2次，加入0.5 mL无血清DMEN培养液，待用。 制备待转染质粒PE-GFP与脂质体混合物如下(下列数据均为每孔加入量)：A液：用一无菌离心管并标记，吸取50 μL无血清DMEM培养液，加入0.8μg的pEGFP-MT质粒至管中，轻轻混匀。B液：用一无菌离心管并标记，吸取50 μL无血清DMEM培养液，加入2 μL脂质体Lipofectamine 2000至管中，轻轻混匀，室温放置5 min孵育。将A、B液轻轻混匀，室温放置20 min孵育。将混合物加入待转染细胞中，前后左右轻轻震荡培养板充分混匀，放于37 ℃的CO2培养箱培养。6 h后换成含10%小牛血清的DMEM培养液继续培养。

1.2.3荧光观察及Western Blot鉴定 转染24 h后，荧光显微镜下观察绿色荧光，以检测转染及表达效率。观察到细胞绿色荧光较强后，PBS洗涤细胞3次，加入适量去离子水，用细胞刮刮下细胞，反复冻融法裂解细胞，12 000 r/min，离心5 min，收集上清，即为细胞表达产物粗提液样品。取16微升样品加入4微升的5X蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min，冷却上样，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶电压90v，分离胶电压120v)。电泳结束后将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入小鼠来源的一抗(anti-GFP,1∶5000)，于4 ℃孵育过夜。洗涤后加入山羊抗小鼠的二抗(1∶5000)孵育1小时，用ECL显色试剂盒显色曝光。内参选用α-Tubulin(一抗二抗都是1∶5000稀释)。

2 结 果

2.1 MT基因的PCR扩增

PCR扩增产物凝胶电泳结果(图1)显示，获得了符合分子大小的基因片段(177bp)，特异性良好，初步显示MT基因PCR扩增成功。

20001000750500250100bpMTMarkerMT

MT: PCR扩增MT产物；Marker:DL2000 DNA marker

图1 MT基因PCR扩增

2.2 菌落PCR及双酶切鉴定

pEGFP-MT重组质粒菌落PCR(见图2)及经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切凝胶电泳结果(见图3)显示，获得了符合MT分子大小的特异性目标条带(177bp),初步表明重组成功。

2.3 重组质粒的测序结果

测序结果(见图4)经序列比对分析表明与NCBI上发表中华绒螯蟹MT序列一致，同源性达到100%，证明载体构建成功。翻译成氨基酸序列见图5。

12345678Marker20001000750500250100bp

1-8:挑选的8个菌落样品；Marker:DL2000 DNA marker

图2 pEGFP-MT菌落PCR

1-3：来自3个菌落样品的质粒；Marker: DL15000 DNA marker

图3 重组质粒双酶切鉴定

2.4 pEGFP-MT质粒转染A549细胞后的荧光观察

转染重组质粒pEGFP-MT 24小时后，A549细胞在荧光显微镜下观察到绿色荧光，细胞形态清晰可见。证明转染成功，MT融合GFP表达良好。(见图 6)

2.5 MT蛋白的Western Blot鉴定

Western Blot结果(见图7)显示，来自GFP-MT样品和空载体GFP样品在预期分子量大小(分别为34.3KD和26.9KD)位置出现了特异性条带，A549细胞纯培养作为阴性对照无条带,3个样品的内参α-tubulin条带良好，符合理论预期，证明MT融合GFP基因成功表达。

图4 重组MT质粒测序结果

MT氨基酸序列

图5 MT编码及氨基酸序列

图6 细胞绿色荧光观察(100×)

A549:未转染质粒的细胞纯培养裂解样品；GFP:转染空载体pEGFP-C1的细胞裂解样品；GFP-MT:转染重组质粒pEGFP-MT的细胞裂解样品

图7 Western Blot结果

3 讨 论

金属硫蛋白(MT)具有许多重要的生理功能，主要有胞内金属代谢、储存和向其它需金属蛋白(主要指锌指蛋白和酶)提供金属离子。MT与锌铜离子可逆结合，含锌MT具有热力学稳定性和动力学不稳定性，能将锌传递给其它需金属蛋白，通过结合和释放金属离子维持生物体内金属离子的代谢平衡。MT还具有重金属解毒、抗氧化、防紫外及参与免疫反应等作用。大量研究表明MT对重金属、氧化试剂、自由基等诱导的凋亡性死亡及非凋亡性死亡具有明显的抑制作用。MT和疾病特别是肿瘤的关系成为研究热点，MT参与肿瘤细胞凋亡、增殖、肿瘤血管形成[4-7]；引起化疗耐药，影响治疗和预后[8]。

大量研究揭示了MT作为生物解毒剂具有广阔的发展空间。MT能结合镉、铅等重金属，且具有较高的结合常数，镉离子能取代锌MT中的锌，形成Cd-MT，重金属离子被MT结合后对生物体的毒性降低[9]，这一特性可用于重金属离子的生物解毒。Azar Shahpiri等做了利用大肠杆菌表达MT吸收砷元素而进行生物解毒的研究[10,11]。Aliya Suleman等进行了MT重组表达对镉元素的吸收研究[12]。Shahpiri等研究了重组MT对汞的吸收[13-16]。R Krishnaswamy等研究了MT对镍的吸收[17]。

中华绒螯蟹是一种经济价值较高的蟹类，关于其MT的研究报道较少，仅有的相关研究主要集中在大肠杆菌原核表达MT[18-20],构建真核表达系统获得MT尚未见文献报道。原核表达蛋白容易造成蛋白折叠错误，缺乏糖基化修饰，易形成包涵体导致蛋白活性丧失等缺点。相对于原核表达系统，真核表达系统在蛋白质分子的折叠、糖基化修饰等方面更有优势，表达的蛋白更接近于天然构象，能最大化保证蛋白的活性。本次实验我们以中华绒螯蟹为研究材料，利用真核表达载体pEGFP-C1构建了中华绒螯蟹MT基因融合绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组表达质粒，转染至A549细胞。A549细胞是人非小细胞肺癌细胞，具有转染效率高，增殖迅速，易培养等特点，因此作为本实验的表达宿主细胞。通过荧光观察和进一步的Western Blot实验，证实了MT基因在A549细胞中成功表达，获得了融合GFP的MT。由真核表达系统表达得到的MT能够最大化的保持其天然结构和活性修饰，为进一步研究中华绒螯蟹MT的结构和功能打下了基础。