不同进口蓝耳病病原抗体ELISA检测试剂盒比较及应用浅析

李乃果 贾松涛

（1河南省荥阳市畜牧局，河南荥阳 450100；2河南省郑州市动物疫病预防控制中心，河南郑州 450052）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起猪的一种高度接触性传染病，其主要特征是引起母猪繁殖障碍及仔猪呼吸道症状。1987年PRRS在北美首次暴发，1996年PRRS在我国大陆地区流行，2006年高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic PRRS,HP-PRRS）在我国暴发。近年来，PRRS类NADC30新毒株在我国流行，成为优势流行毒株之一。感染母猪主要表现为繁殖障碍，如发情不典型、受孕率低、流产、难产、木乃伊胎、弱仔及死胎等症状。患病仔猪主要表现出呼吸道疾病，咳喘、被毛粗乱、生长缓慢及死亡率增加。PRRSV感染猪常导致机体免疫抑制，使机体易受环境和条件性病原的影响，伴随其他疾病发生，如与猪支原体病、副猪嗜血杆菌病、猪流感及仔猪断奶后多系统衰竭综合征、猪呼吸道病综合征等疾病混合感染、多重感染。PRRS是对中国养猪业造成重大损失的猪病之一。早期监测和防控PRRS，对控制PRRS在猪场的稳定尤为重要。

目前，市场上销售的检测PRRS抗体的试剂盒有多种，尤其是进口试剂盒在国内市场上有多个商业品牌，实验室或者养殖场在选择检测试剂盒的时候往往无所适从。

笔者选购了市场上占有率较高的4种PRRS抗体检测试剂盒，并筛选出其中1种敏感度较高、符合猪场临床生产要求的试剂盒，以期为其他实验室或者养殖场科学合理选择PRRS抗体检测试剂盒提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

PRRS病原阴/阳性血清，由河南天驰生物科技公司提供。

选择4种进口PRRS抗体检测试剂盒，分别由I、J、B、L公司生产。

一次性1.5 mL离心管、精密微量移液器（50～1 000μL）、移液滴头、微量振荡器、酶标仪、台式离心机、隔水式培养箱等实验器材。

1.2 检验方法及结果判定标准

对于每份待检血清，分别用上述4种进口PRRS抗体检测试剂盒检测，分析其符合率，以此比较各方法差异。检测及结果判定均按照说明书方法进行。

I厂家试剂盒以核衣壳蛋白为包被抗原，可以检测EU/US毒株抗体，结果判定标准是S/P值（样品OD值/阳性对照平均OD值）≥0.4为阳性，S/P值＜0.4为阴性。J厂家试剂盒以核衣壳蛋白为包被抗原，只能检测US毒株抗体，结果判定标准是S/P值≥0.4为阳性，S/P值＜0.3为阴性，S/P值介于0.3～0.4之间为可疑。B厂家试剂盒以灭活PRRS EU/US病毒为包被抗原，只能检测EU或者US毒株抗体，结果判定标准是S/P值≥0.4为阳性，S/P值≤0.399为阴性。L厂家试剂盒包被的是膜蛋白（M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5），只能检测US毒株抗体，结果判定标准是IRPC 值 ﹝（样品OD值-阴性对照平均OD值）/（阳性对照平均OD值-阴性对照平均OD 值）﹞ ＞20为阳性，IRPC值≤20为阴性。

2 检验结果

2.1 检测阳性样品的试剂盒敏感性比较

取1份已知为PRRSV阳性的样品，该样品为PRRS美洲株免疫的高免血清，将阳性样品用相应的样品稀释液进行 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍比稀释，评估I、J、B、L不同厂家试剂盒的检测敏感性。结果表明，I厂家试剂盒在样品进行10-4稀释后仍然可以检测到抗体，J和B厂家试剂盒在样品稀释后检测不到抗体，因此，I厂家的敏感性最好（见表1）。

2.2 检测免疫过PRRS疫苗的血清样品的试剂盒敏感性比较

取2份已免疫过PRRS疫苗（免疫疫苗为高致病性蓝耳病冻干活疫苗，天津株）的血清样品，分别标记为血清样品1、血清样品2，将待检样品用相应的样品稀释液进行 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍比稀释，按照各试剂盒操作要求，检测血清中的抗体水平，评估不同厂家试剂盒的检测敏感性。结果显示，I厂家的试剂盒在血清样品1和血清样品2分别稀释10-6和10-7后，仍然可以检测到样品抗体阳性；J厂家的试剂盒在血清样品1和血清样品2分别稀释10-2和10-3后，可以检测到样品抗体阳性；B厂家的试剂盒在血清样品1和血清样品2分别稀释10-2和10-4后，可以检测到样品抗体阳性；L厂家的试剂盒在血清样品1和血清样品2均是稀释10-4后，可以检测到样品抗体阳性；从稀释倍数数据比较说明I厂家的试剂盒敏感性最好，J、B、L三个厂家敏感性相当（表2）。

3 应用PRRS抗体检测数据建立猪场PRRS抗体基准线

各养猪企业可以基于长时间的PRRS抗体水平检测数据积累和处理经验建立本企业的PRRS抗体水平基准线，也就是所谓的“baseline values”。基准线的建立是一项系统工程，一旦建立了属于本场的生产基准线，便可快速评估免疫程序是否合理，有效分析日常检测数据，增强检测结果的生产指导意义，避免经验主义，及时判断整个猪群有无潜在的安全隐患。

如果检测数据偏离基准线，则提示生产环境中发生了某些改变，如感染疾病、免疫失败等。如果检测的抗体滴度值远高于正常的抗体水平，则提示存在野毒感染的可能性；如果检测的抗体滴度值低于预期的疫苗免疫应答滴度，则表明免疫程序不合理或者疫苗质量有问题。但每个猪场的基准线并不一样，应该结合本场的实际情况综合判断。

基于大量的PRRS抗体检测数据并结合多数猪场的饲养管理状况，总体出PRRS抗体与猪场生产性能存在相关性：①高性能生产水平、健康且持续稳定的猪场，符合S/P值≥2.0的个体占整个群体的比例≤10%，S/P值≥2.5的个体出现比率低（≤5%）或不出现，种猪群体S/P值介于0.4～1.5之间，群体占比80%～90%；②中等偏上水平、健康稳定且偶有波动的猪场，S/P值≥2.0的个体占整个群体的比例≤20%，S/P值≥2.5的个体占整个群体的比例≤10%，S/P值≥3.0的个体不出现或很少出现（≤5%），种猪群体S/P值介于0.4～1.5之间，占70%～80%；③中等性能水平、季度性出现波动的猪场，S/P值≥2.0的个体占整个群体的比例在20%～30%。

表1 阳性样品试剂盒敏感性检测结果

表2 免疫过PRRS疫苗的血清样品的试剂盒敏感性检测结果

4 结论与分析

⑴通过检测PRRS抗体水平建立抗体水平基准线并在实际生产中应用是一项积极的探索，并且可以推广至其他疫病的监测上。

⑵通过对样品进行实验室血清学的检测并对照建立抗体水平基准线，能够及早发现某种疫病免疫程序中可能存在的问题，可以为猪场提供风险预警，便于查找风险点并及时进行防控。

⑶猪场PRRS抗体的水平与其保护力不是正相关的关系，检测的PRRS抗体阳性率并不能代表对PRRS的保护力。目前的抗体检测方法不能区分PRRSV流行毒株感染产生的抗体和疫苗免疫产生的抗体；检测的抗体水平一般都是总抗体水平，不代表中和抗体水平。但是抗体阳性率和平均值，可以反映PRRS的稳定状态，个体动物或者整个猪群的S/P值的走势能够反映PRRS感染所处的阶段，可用于分析疾病处于感染初期还是转归阶段。