有氧运动对大鼠海马和前额叶皮层ERK/CREB/BDNF信号通路的影响

李艳荣，兰顺领，晋 倩

（1.巢湖学院 体育学院，安徽 合肥 238000；2.广东酒店管理职业技术学院 体育与艺术系，广东 东莞 523900）

抑郁症、阿尔兹海默症（AD）、帕金森病（PD）等多种神经性疾病都伴有脑部萎缩，主要表现为神经元的逐渐凋亡、神经元细胞呈现退化趋势，记忆力衰退等［1-3］.当今快节奏的社会环境中，神经退行性疾病呈现年轻化趋势、发病率逐渐升高.医学研究表明神经元退行性疾病患者脑组织神经元存在可再生性［4］.

ERK/CREB/BDNF信号通路是治疗神经退行性疾病的重要途径和作用靶点之一［5］.脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是神经营养因子家族的一员，研究发现BDNF不仅能起到营养神经的作用，而且能够促进神经元再生，在神经退行性病变方面有很高的研究价值［6］.cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是一种在大脑中广泛表达的核转录因子，近年研究发现，CREB可能是应激性损伤后细胞存活的关键因素，具有重要的抗凋亡效应［7-8］.细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）是引起CREB磷酸化的重要激酶.有文献报道，只有磷酸化的CREB才能激活下游基因BDNF的表达［9］.本研究通过观察3周无负重游泳运动后大鼠海马和前额叶皮层ERK/CREB/BDNF信号通路蛋白表达的情况，探讨运动预防神经退行性病变的机制.

1 实验材料和方法

1.1实验动物及分组

8周龄SPF级健康雄性SD大鼠20只，购于广州中医药大学实验动物中心［动物生产许可证：SCXK（粤）2013-0034］，体重为 180～220 g.动物房环境温度 25±2℃，相对湿度 50%～65%.自由进食进水、自然昼夜，自然饲养一周后随机分为空白对照组（C组）和运动组（E组）两组，10只/组.C组大鼠自然饲养，自由进食进水；E组大鼠进行3周无负重游泳.

1.2主要试剂

兔抗P-ERK1/2蛋白单克隆抗体：美国Abcam公司；兔抗CREB蛋白单克隆抗体：美国Abcam公司；兔抗P-CREB蛋白单克隆抗体：美国Abcam公司；兔抗BDNF蛋白多克隆抗体：美国CST公司.

1.3 运动方案

运动组在适应性喂养结束后进行3天适应性游泳训练，每天10 min，之后进行正式运动干预；游泳运动方案采用3周无负重游泳，第一周采用递增运动负荷方式，第一天20 min，第二天25 min，第三天30 min，以后每天递增10 min，直到60 min/天.第二周、第三周6次/周，60 min/天.

1.4 组织样本的取材

在第三周实验结束后24 h，根据大鼠体重腹腔注射10%水合氯醛（0.35～0.4 ml/kg）进行麻醉，腹主动脉取血后断头取脑，清洗并分离出海马和前额叶皮层，分别用锡纸包埋立即放入液氮中，-80℃保存，待测指标.整个取脑过程在冰面上快速进行操作，取材均由同一人完成.

1.5 组织蛋白的测定

用Western Blotting方法检测海马和前额叶皮层P-ERK1/2、CREB、P-CREB、BDNF的表达量.将适量组织加入组织裂解液进行匀浆、离心、浓缩、蛋白定量后，在沸水中煮8 min使蛋白质变性.用BCA法测定蛋白浓度，与加样缓冲液混匀，加样25 ul，进行SDS-PAGE电泳分离、转膜，将转移好的PVDF膜放入10%脱脂奶粉封闭液中封闭 2 h，PBST 洗膜 5次，每次 5 min.加 P-ERK1/2抗体（1∶1 000）、CREB 抗体（1∶2 000）、P-CREB 抗体（1∶1 000）、BDNF 抗体（1∶1 000）孵育过夜，PBST 洗膜 5 次，每次 5 min.加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000）孵育1 h，PBST洗膜5次，每次5 min.应用ECL荧光底物混合液浸泡PVDF膜，室温孵育3～5 min后，用滤纸擦干，于暗室曝光，胶片显影、定影.

1.6 统计学分析

使用SPSS 21.0统计软件处理数据，结果均用平均数±标准差（X¯±S）表示，组间比较采用独立样本T检验，P＜0.05表示差异具有显著性，P＜0.01表示差异具有非常显著性.

2 实验结果

2.1 两组大鼠海马相关蛋白的表达

与 C 组相比，E组大鼠海马 P-ERK1/2、CREB、P-CREB、BDNF蛋白表达量均明显增加（P＜0.01）.其中P-ERK1/2约平均升高1.5倍，CREB约平均升高1.7倍，P-CREB约平均升高2.3倍，BDNF约平均升高3.4倍（见图1及表1）.

图1 两组大鼠海马信号通路蛋白的表达

表1 两组大鼠海马信号通路相关蛋白的相对表达（±S）

表1 两组大鼠海马信号通路相关蛋白的相对表达（±S）

注：与 C 组相比，*代表 P＜0.05 ，**代表 P＜0.01，下同.

指标 P-ERK/GAPDH C 1.37±0.02 E 2.07±0.06**CREB/GAPDH 1.30±0.10 2.20±0.11**P-CREB/GAPDH 0.31±0.02 0.73±0.04**BDNF/GAPDH 0.33±0.04 1.12±0.07**

2.2 两组大鼠前额叶皮层相关蛋白的表达

与C组相比，E组大鼠前额叶皮层P-ERK1/2、CREB、P-CREB、BDNF蛋白表达量均明显增加（P＜0.01）.其中P-ERK1/2约平均升高1.5倍，CREB约平均升高1.6倍，P-CREB约平均升高4.1倍，BDNF约平均升高4倍（见图2及表2）.

图2 两组大鼠前额叶皮层信号通路蛋白的表达

表2 两组大鼠前额叶皮层信号通路相关蛋白的相对表达（±S）

表2 两组大鼠前额叶皮层信号通路相关蛋白的相对表达（±S）

指标 P-ERK/GAPDH C 2.06±0.06 E 3.06±0.08**CREB/GAPDH 1.56±0.07 2.44±0.09**P-CREB/GAPDH 0.21±0.02 0.87±0.03**BDNF/GAPDH 0.29±0.02 1.18±0.06**

3 分析讨论

ERK1/2是MAPKs家族中的重要成员，在未受到细胞刺激时，ERK1/2分布在胞质中，被激活磷酸化后则进入细胞核调节CREB等核转录因子的活性，发挥细胞调节作用；未进入核内活化的ERK停留在胞浆，可磷酸化细胞骨架蛋白，调节细胞形态及骨架的重分布［10］.

大量研究发现ERK是海马树突结构形成所必需的，与学习记忆功能密切相关.CREB参与神经元的再生过程，记忆训练活动可以促进CREB的激活，增加P-CREB基因的表达，这种现象在大脑皮质和海马区均有发生［11］.通过手术切断双侧海马伞或者向大鼠海马内注入CREB的反义寡核苷酸，然后对大鼠进行学习记忆行为的训练，大鼠逃避行为减弱、记忆力衰退，这种现象伴随海马P-CREB表达的下降［12］.

Roberson等用ERK拮抗剂作用于海马CA1区血小板凝集抑制剂激活的CREB，最终P-CREB表达量显著下降［13］.被激活的CREB可以促进BDNF和其受体TrkB的表达，注入CREB的反义寡核苷酸可以抑制BDNF的上调［14］.研究发现，BDNF的作用不仅是营养保护神经元，还参与神经损伤后的再生过程［15］.李小龙研究表明，4周单纯有氧运动可以非常显著性的上调P-ERK的表达，而总蛋白表达量没有差异［16］.这说明有氧运动是通过上调P-ERK的表达，起到了预防Aβ引起的海马炎症反应的作用，而不是通过ERK蛋白本身.赵燕研究表明，每天自主跑轮运动1 h，连续进行8周，可以非常显著性的促进大鼠海马P-ERK的表达［17］.Shen等报道一次自愿跑轮运动可以增加大鼠海马P-CREB的表达，并发现CREB与BDNF基因CRE序列的结合增加，促进BDNF基因的转录，这次运动的效果可以持续一周［18］.Vaynman等发现一周自愿运动不但可促进CREB的磷酸化水平，而且发现CREB mRNA基因表达增加［19］.MJChen发现，2周的跑轮运动训练后P-CREB的水平升高约60倍，如果配合抗抑郁药物的使用，甚至可升高90倍［20］.长时间运动可以提高BDNF的表达，BDNF的高表达有抗抑郁、提高应变能力的效果，还可以延缓由衰老引起的认知功能的退化.

4结语

研究结果显示3周游泳运动可以增加大鼠海马和前额叶皮层神经元ERK/CREB/BDNF信号通路蛋白的表达，增强神经元的可塑性，从而保护神经元免受损伤、参与神经元损伤后修复，有氧运动对皮层ERK/CREB/BDNF信号通路相关蛋白表达的促进作用强于海马.