以斑马鱼为疾病模型的小分子药物筛选研究进展❋

赵呈天， 贾 硕， 张晓丽

(中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所，山东 青岛 266003)

斑马鱼(Daniorerio)是一种硬骨鱼，原产于南亚，属于辐鳍鱼纲(Actinopterygii)，鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，短担尼鱼属(Danio)。它是典型的亚热带淡水观赏鱼类，体表分布有蓝色银色相间的条纹，类似斑马身上的条纹，故被称为斑马鱼。斑马鱼体型纤细，性情温和，容易饲养，对水质要求不高且生长周期较短，3个月左右达到性成熟。繁殖周期通常在一周左右，一次产卵量可达几百枚。卵子体外受精，体外发育，其胚体透明，胚胎发育同步且速度快，可以在不损伤胚胎的前提下清晰地观察斑马鱼胚胎各器官的生长发育情况。

正因为其具备上述这些特点，引起了科学家的广泛关注。近年来，以斑马鱼为模式动物的科研工作发展迅速，斑马鱼全基因组测序的完成[1-2]极大加速了对其基因功能的深入研究，同时整胚原位杂交技术、以CRISPR/Cas9为代表的基因敲除技术[3]、以反义MO为代表的基因敲降技术[4]和转基因技术等都可很好的应用于斑马鱼基因功能研究中。研究发现，斑马鱼虽然在器官构造和形态方面与人类不尽相同，但是在细胞和分子水平上与人类十分相似。有研究表明，大约70%的人类基因至少有一个明显的斑马鱼直系同源物[2]，通过大规模诱变筛选，英国Wellcome Trust Sanger研究所已经建立了超过3 000个与人类疾病相关的基因的突变品系[1]。这些结果表明，斑马鱼不仅是研究脊椎动物发育过程的理想模型，也是模拟人类疾病的良好模型。

1 斑马鱼在小分子药物筛选中具有非常大的优势

小分子化学药物的筛选在近几年的研究中发展迅速，多种方法被运用到筛选当中。首先是较传统的体外筛选，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞的体外筛选等，这种筛选方法的缺点比较明显。第一，一些特殊类型的细胞和大多数器官在体外无法培养或重建；第二，体外培养的细胞无法模拟体内细胞外的微环境；第三，体外培养无法模拟疾病的发展过程。为了解决体外药物筛选的缺陷，研究人员又采用无脊椎模式生物，其中果蝇和线虫最具代表性。但是无脊椎动物往往缺乏复杂的系统和器官，其形态和结构也与人类相去甚远，因此只能在一些特定的筛选中发挥作用。与传统的体外细胞培养以及简单的无脊椎动物模型(如果蝇和秀丽隐杆线虫)的小分子药物筛选不同，斑马鱼提供了一个完整的用于药物发现的活体脊椎动物系统，兼之其强大的繁殖能力和低廉的饲养成本，使得体内模型的生物学复杂性与高通量筛选的能力结合在一起(见图1)。同时，因为药物在体内发挥作用，因此在评估药物功能的同时还能兼顾药物毒性。转基因斑马鱼能够通过荧光蛋白标记特定的组织器官，因此仅通过荧光检测就能初步判断药物效果，为药物筛选带来了很大的便利。

(首先通过交配获取大量的转基因或突变体品系胚胎，待发育至特定阶段后进行小分子药物孵育处理，并在发育过程中分析胚胎的多种生物学性状，如利用高通量设备检测胚胎基因表达水平，形态发育及行为学检验等，确定命中的小分子药物。之后，再通过哺乳动物模型实验及临床试验进行进一步的药理学检验，最终获得可用于生产销售的新型药物。The transgenic or mutant embryos are first incubated with small molecule drugs for a desired period of interest.Then,the treated embryos are analyzed with different methods,including phenotypic analysis,high-throughput detecting of gene expression level and/or behavioral tests to determine the potential hits.After that,further pharmacological tests can be conducted on mammalian models.If the compound is approved for safety and efficacy,clinical trials will be further conducted to determine whether it can be approved as a new drug.)

图1 常用斑马鱼小分子药物筛选流程Fig.1 Small molecule screening strategy for drug discovery using zebrafish model

续表1

疾病Diseases斑马鱼品系Zebrafish lines小分子药物Small molecule drugs分子机制Molecular mechanisms参考文献References肝细胞癌Hepatocellular carcinomaTg(fabp10a:pt-β-cat)SP600125、阿米替林(Amitriptyline)、帕罗西汀(Paroxetine)SP600125通过抑制JNK途径抑制肿瘤发生,阿米替林和帕罗西汀可能通过抑制5-羟色胺途径发挥作用。[22]乳腺癌Mammary cancerTg(cldnb:EGFP)大黄素(Emodin),SU6656,RBI抑制原癌基因Src途径。[23]Tg(kdrl:EGFP)s843IT1t拮抗趋化因子受体CXCR4。[15]脂肪肝Hepatic adiposeinfiltrationWT依泽替米贝(Ezetimibe)和辛伐他汀(Simvastatin)具体机制不明。[27]糖尿病DiabetesTg(tp1:hmgb1-mCherry;pax6b:GFP)霉酚酸(MPA), 戒酒硫(DSF)霉酚酸通过抑制GTP的产生促进β细胞的分化,戒酒硫通过抑制视黄酸信号诱导继发性β细胞的分化。[28]Tg(ins:PhiYFP-2a-nfsB; sst2: tagRFP)小白菊内酯(Parthenolide)和硫辛酸(Thioctic acid); 帕罗西汀(Paroxe-tine)和阿米替林(Amitriptyline)小白菊内酯和硫辛酸抑制NF-κB通路增强了β细胞的分化,帕罗西汀和阿米替林则是通过5-羟色胺途径增强β细胞的分化。[29]Tg(lfabp:GAL4-VP16;UAS: nfsB-mCherry)阿立西定(Alexidine)通过抑制PTEN样线粒体磷酸酶PT-PMT1来降低血糖水平。[30]铁代谢病Disorders of iron metabolismTg(ubi:Fpn-GFP); pgrmc1 morphants表雄醇(Epitiostanol)、孕酮(Proges-terone)和米非司酮(Mifepristone)增加铁调素的生物合成来降低铁转运蛋白的水平。[32]线粒体病MitochondriopathyWT普罗布考(Probucol)抑制mTORC1信号,激活AMPK和PPAR通路信号。[35]Dravet 综合征Dravet syndromescn1 mutants芬氟拉明(Fenfluramine)调节5-羟色胺信号通路[37]癫痫 Epilepsykcna1 morphants伏立诺他(Vorinostat)组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂[38]肌肉疾病Myopathiesher1、hes6 mutantsSB225002,XRP44XSB22502抑制斑马鱼中的趋化因子受体Cxcr2功能,XRP44X可以影响Ras-Elk信号传导途径,并抑制微管聚合。[39]骨质疏松OsteoporosisWTRWJ-60475, 盐酸左旋咪唑(Levami-sole HCL), 盐酸四咪唑(Tetramisole HCL), 氰戊菊酯 (Fenvalerate), NSC-663284, BML-267酯(BML-267ester); BML-267, 潘它米丁(Pen-tamidine)。调节破骨细胞和BMP相关途径。[40]

2 斑马鱼作为疾病模型在药物筛选中的应用

相对于其他脊椎动物而言，斑马鱼具有低成本、短周期、便于高通量筛选等显著优势，目前已经被应用于药物筛选的多个方面(见表1)，下面介绍一下斑马鱼作为不同疾病模型的药物筛选研究进展。

2.1 循环系统疾病

心脏病是一种常见的循环系统疾病，大多无法彻底治愈且经常复发，给患者和社会造成了很大负担。研究表明，增强心肌细胞的增殖能力，使心脏具有再生潜能可能是一种有效的治疗方式。最近，Magadum等筛选出一种诱导心肌细胞增殖的小分子—carbacyclin，并利用斑马鱼、小鼠等研究表明该小分子可以通过激活PPARδ/ PDK1 / p308Akt /GSK3β/β-catenin通路促进心肌细胞再生[5]。

在造血方面，虽然斑马鱼与人类造血的部位不尽相同，但在基因调控方面仍然保持着较高的同源性。2007年，Zon课题组报道了他们的研究成果：通过药物筛选，他们发现增强前列腺素E2(Prostaglandin E2)合成的化合物能够增加造血干细胞的数量，并且前列腺素E2本身也能够增加斑马鱼和小鼠中造血干细胞和多能祖细胞(Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)的数量，调节造血干细胞的体内平衡[6]。后来的研究表明，前列腺素E2及其衍生物在促进脐带血细胞移植后造血干细胞增殖上也发挥重要作用[7-8]。2015年，Zon课题组通过构建HSPCs特异的转基因斑马鱼品系，筛选出TGF-β受体抑制剂SB-431542以及石蒜碱(Lycorine)等促进HSPCs增殖的小分子化合物[9]。同年，Li等使用斑马鱼全肾骨髓(Whole kidney marrow, WKM)移植的方法，将带有荧光的斑马鱼全肾骨髓细胞移植入经过亚致死剂量照射的casper突变体中，通过观察荧光强度来确定药物是否有效，经过筛选发现环氧二十碳三烯酸(EETs)可以有效的增加植入骨髓细胞的数量[10-11]。这些研究都表明，斑马鱼作为疾病模型在循环系统的药物筛选方面发挥了重要作用。

2.2 癌症

癌症是当今社会人类健康的最大威胁之一，有关癌症药物的研发一直是人们关注的重点。斑马鱼作为人类癌症模型已广泛的应用于药物筛选中，包括黑色素瘤[12]，白血病[13]，结肠癌[14]，乳腺癌[15]等。

黑色素瘤是一种皮肤癌，除了家族遗传，基因突变以外，过度暴露于阳光和紫外线也是发病的主要原因，其中转移性黑色素瘤有着较高的致死率[16]。White等利用转基因Tg(mitf-BRAFV600E;p53-/-)品系构建了黑色素瘤的斑马鱼动物模型，发现黑色素瘤形成过程中存在神经嵴祖细胞分化异常的现象，而二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂, 如来氟米特(Leflunomide),可以抑制神经嵴发育和黑色素瘤的生长[17]。基于这个发现，2016年，同课题组的Tan等将转录延长调节因子HEXIM1成功鉴定为黑色素瘤抑制因子[18]。Dang等采用了对成年斑马鱼口服灌胃技术，筛选抑制黑色素瘤生长的药物，通过研究发现，使用BRAFV600E特异性抑制剂维罗非尼(Vemurafenib)以亚致死剂量给药2周，可对约65%个体的肿瘤生长产生抑制效果[19]。最近，Kim等筛选出了一批能够诱导黑色素瘤细胞增殖分化的微环境因子，其中内皮素3(EDN3)及其合成酶ECE2能够强烈的促进黑色素瘤的转移性生长，而CRISPR介导的EDN3和ECE2的失活能够显著增加患黑色素瘤动物的存活率[20]，该结果表明微环境在转移性黑色素瘤分化中的重要功能，也为这一恶性肿瘤的治疗提供了潜在靶点。

β-catenin是Wnt信号通路中的一个重要成员，编码β-catenin的CTNNB1基因突变是肝细胞癌的主要特征之一[21]，Evason等利用Tg(fabp10a:pt-β-cat)转基因斑马鱼，发现SP600125、阿米替林(Amitriptyline)和帕罗西汀(Paroxetine)能够抑制β-catenin诱导的肝脏生长，其中阿米替林还在小鼠肝癌模型中有一定的治疗作用[22]。

癌细胞的转移是癌症发展过程中的重要一步，斑马鱼侧线原基细胞在发育中的迁移过程可以部分模拟肿瘤细胞的转移。Gallardo等利用斑马鱼Tg(cldnb:EGFP)转基因品系特异标记侧线原基细胞，筛选出了165种无明显毒性且干扰侧线原基迁移的小分子药物，包括三种与神经嵴细胞迁移相关的Src信号通路抑制剂：大黄素(Emodin)，SU6656和RBI。进一步研究发现，在小鼠中SU6656也具有抑制乳腺癌细胞转移的作用[23]。

肿瘤异质性(Tumor heterogeneity)[24]是癌症治疗的一大难题，即使是相同基因组相同克隆的肿瘤细胞也会产生对治疗的不同反应[25]，因此，对待不同的癌症患者可能也要采取不同的治疗方案。小鼠异种移植是体内评估肿瘤异质性的良好手段，但由于其生长所需时间及高额的成本，使得这种方法在临床中并不实用。斑马鱼胚胎具有透明度高、生长周期短和饲养成本低的特点，利用斑马鱼研究人类肿瘤细胞异种移植是研究肿瘤异质性的良好方法。目前，已经有科学家利用异种移植构建出了斑马鱼三阴性乳腺癌模型，筛选到了一种有效的CXCR4拮抗剂IT1t，它能够阻碍三阴性乳腺癌的早期转移[15]，同时也证明了异种移植的有效性。后来，Fior等用亲脂性染料(DiI)标记人类肿瘤细胞并注射到受精48 h后的斑马鱼胚胎卵黄细胞间隙中，在注射4 d后，几乎所有的细胞系都有70%以上的植入率。用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)标记了正在进行DNA复制的细胞后，发现植入的人类肿瘤细胞处于活跃增殖状态。接下来，他们将人肿瘤细胞注射到标记血管系统的Tg(fli：EGFP)转基因斑马鱼品系中，发现这些肿瘤细胞聚集区域形成类似人类肿瘤的血管系统[14]。这些实验结果证明人肿瘤细胞在斑马鱼异种移植中保持其无限增殖及肿瘤生成潜力。

2.3 代谢疾病

斑马鱼同样可以作为重要的代谢疾病模型[26]。脂肪肝是一种肝脏代谢综合征，可进一步发展为肝硬化或者肝细胞癌。随着人们生活水平的不断提高，脂肪肝的发病率也在逐渐上升，了解脂肪肝发病的分子机制，筛选到能够治疗脂肪肝的小分子药物，其意义十分重大。研究人员对高脂肪(HF)饮食和高脂肪加高胆固醇(HFC)饮食喂养的斑马鱼幼鱼进行比较，模拟了肝脂肪变性的疾病模型，并验证了依泽替米贝(Ezetimibe)和辛伐他汀(Simvastatin)这两种药物具有改善HFC诱导的肝脂肪变性的功能[27]。

人类的1型糖尿病是由于胰岛β细胞的T细胞依赖性破坏引起的。有研究表明，哺乳动物中的胰岛β细胞具有再生能力，调节血糖稳态的一种方法就是诱导胰岛β细胞的内源性再生。Rovira等利用Tg(Tp1:hmgb1-mCherry)和Tg(pax6b:GFP)的双转基因斑马鱼，跟踪了次级胰岛(Secondary islets)的形成及β细胞的早期分化过程，并筛选到了两种促进胰岛β细胞分化的药物(MPA和DSF)，其中霉酚酸(MPA)通过抑制GTP的产生发挥功能，而戒酒硫(DSF)通过抑制视黄酸(RA)信号诱导次级胰岛的早期分化[28]。后来，Wang等同样得到了两类促进β细胞分化的小分子，其中I类的小白菊内酯(Parthenolide)和硫辛酸(Thioctic acid)通过抑制NF-κB通路增强β细胞的分化，而II类的帕罗西汀(Paroxetine)和阿米替林(Amitriptyline)可能通过激活5-羟色胺通路促进β细胞的分化[29]。Nath等则是筛选到了一种在斑马鱼体内有效的小分子降糖剂阿立西定(Alexidine)，并用其他药理学和遗传手段鉴定出阿立西定通过抑制PTEN样线粒体磷酸酶PTPMT1来降低斑马鱼体内的葡萄糖水平[30]。

铁调素(Hepcidin)是由肝细胞产生和分泌的一种小分子激素，在调节体内铁代谢的过程中发挥重要作用。铁调素水平升高，会导致低铁血症，相反则会引起高铁血症[31]。Li等在斑马鱼中筛选到3种类固醇分子：表雄醇(Epitiostanol)、孕酮(Progesterone)和米非司酮(Mifepristone)，它们可以增加铁调素的生物合成来降低铁转运蛋白(Ferroportin)的水平，从而进一步影响体内铁元素水平，是治疗铁代谢疾病的候选药物[32]。

线粒体呼吸链(Respiratory chain,RC)疾病是一种异质性和高度病态的能量缺乏症，临床表现为严重的神经发育异常、心脏病、肌肉相关疾病、肾病、肝病、内分泌紊乱、听力及视力障碍等[33-34]，目前尚无有效的治疗方法。鱼藤酮(Rotenone)、叠氮化物(Azide)、寡霉素(Oligomycin)和氯霉素(Chloramphenicol)分别为线粒体酶复合物I，IV，V和线粒体翻译的抑制剂，它们都是线粒体呼吸链毒素，Byrnes等利用这四种化合物建立了斑马鱼线粒体功能障碍模型，筛选到普罗布考(Probucol)能够预防鱼藤酮诱导的脑死亡，并能显著的挽救鱼藤酮或寡霉素暴露下的早期胚胎发育延迟[35]。

2.4 神经疾病

与其他治疗领域的药物相比，神经类疾病的候选药物在临床试验中表现出较高的失败率，这可能是由于血脑屏障的存在和神经性疾病的多基因性。最近，Bruni等报导了一种可用于神经药物筛选的斑马鱼行为学分析方法：首先，利用已知的神经药物(如氟哌啶醇，Haloperidol)对7 d大小的斑马鱼幼鱼进行处理，然后利用不同波长和频率的声觉和视觉组合对处理组及对照组幼鱼进行刺激，依据其行为学差异建立起该神经药物的功效参考体系。最后，依据该参考体系筛选具有类似效果的小分子化合物。作者通过该筛选系统，鉴定出了Finazine等小分子，并在体内证明其发挥类似于氟哌啶醇的药理作用，表明这套分析方法可用于具有类似机制的神经活性化合物的筛选[36]。

此外，Dinday等利用斑马鱼scn1突变体构建了一种癫痫性脑病—Dravet 综合征的动物模型，并利用小分子筛选鉴定出包括芬氟拉明(Fenfluramine)在内的多种抗癫痫潜在药物[37]。最近，Ibhazehiebo报道了一种组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂伏立诺他(Vorinostat)，这种药物能同时减少斑马鱼和小鼠模型中癫痫发作的频率，并提出同时抑制HDAC1和HDAC3可能是一种新的癫痫治疗的模式[38]。

2.5 肌肉和骨骼疾病

肌肉是人体重要的运动器官，肌纤维的形成与微管有非常密切的关系，微管异常可能导致各种肌肉相关疾病。Richter等结合原位杂交和突变体表型分析方法，筛选了影响体节分化的重要信号分子，鉴定出影响肌节边界形成的重要小分子—SB225002，而另一种小分子—XRP44X，则通过影响微管的稳定性，进而影响肌肉细胞的伸长和功能[39]。

骨骼的形成是一个动态平衡的过程，包括成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收，这个平衡如果被打破就会出现一系列骨疾病，包括骨硬化、石骨症和骨质疏松症等。Chen等开发了斑马鱼抗骨质疏松药物的快速筛选方法，利用钙黄绿素(Calcein)作为骨矿化评估的染料，筛选到两种增加骨矿化的化合物：潘他米丁(Pentamidine)和BML-267，而另外六种化合物RWJ-60475，盐酸左旋咪唑(Levamisole HCL)，盐酸四咪唑(Tetramisole HCL)，氰戊菊酯(Fenvalerate)，NSC-663284和BML-267酯(BML-267ester)对骨矿化有抑制作用[40]。

此外，斑马鱼还被用作多囊肾[41]、视网膜变性[42]、背腹发育异常[43]等多种疾病模型应用于小分子药物筛选，本文不再一一赘述。

3 结语

目前为止，研究人员已经构建出多种转基因斑马鱼和突变体，这些都将成为良好的人类疾病模型，利用这些疾病模型进行药物筛选的优势非常明显，首先可以非常清楚的观察到斑马鱼体内组织器官的前后变化，对药物效果进行合理评估；其次，可以在活体内进行药物毒性和副作用的初步评估；再者，可以为后续高等动物的临床试验提供参考，降低成本和工作量。当然，这种筛选方法也存在着缺点。第一，目前斑马鱼表型主要通过人工观察，对于药物命中效果的界定比较困难。第二，虽然斑马鱼基因与人类相似度较高，但是实际编码的蛋白存在着一定差异，这也就意味着部分适用于斑马鱼的药物在人类体内不能达到预期效果。总的来说，斑马鱼作为疾病模型在药物筛选上的应用前景非常广阔，相信随着科学技术的进一步发展，将会有越来越多的药物被筛选出来，为人类医学研究做出巨大的贡献。