多重PCR技术检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因研究

余文杰

摘要    气溶素和溶血素是β-溶血性嗜水气单胞菌的重要毒力因子。为建立检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素基因（aerA）和溶血素基因（ahh1）的技术，本文采用多重PCR技术检测28个来源于食用鱼类产品的β-溶血性嗜水气单胞菌样本（包括鲤鱼片、水、鲫鱼片、鳟鱼片、鲢鱼片、鲑鱼片和带鱼片），并用标准菌株嗜水气单胞菌ATCC7965和分离于死蟒蛇的带有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作为对照。结果表明，所有菌株样本（100%）被证实携带嗜水气单胞菌16S rRNA基因（356个碱基对），所有嗜水气单胞菌样本（100%）被证实携带ahh1毒性基因（130个碱基对），26个嗜水气单胞菌样本（93%）被证实携带aerA基因（309个碱基对）。本研究证实β-溶血性嗜水气单胞菌菌株广泛存在于供人类食用的鱼类产品中，对消费者产生了一定的健康风险。

关键词    食用鱼类产品;嗜水气单胞菌;多重PCR;气溶素;溶血素

中图分类号    TS254.5        文献标识码    A        文章编号   1007-5739（2019）11-0217-02

Abstract    Aerolysin and haemolysin are viewed as important virulence factors related to the entero-toxigenicity of β-haemolytic Aeromonas hydrophila. In order to establish a method for detection of genes coding aerolysin（aerA）and haemolysin（ahh1）in β-haemolytic A. hydrophila strains isolated from edible fish products，a multiplex PCR was applied to detect the β-haemolytic A. hydrophila strains isolated from 28 samples of edible fish products（including carp cutlets，water，crucian cutlets，trout cutlets，silver carp cutlets，trout cutlets and hailtail cutlets），and the study used a reference A. hydrophila strain（ATCC 7965）and an A. hydrophila strain isolated from a dead anaconda，as positive controls with strong  β-haemolytic activity. The results showed that the chromosome gene 16S rRNA（356 bp）was confirmed in all A. hydrophila strains（100%），the gene ahh1（130 bp）was confirmed in all A. hydrophila strains（100%），and the gene aerA（309 bp）was confirmed in 26 A. hydrophila strains（93%）. The presence of β-haemolytic A. hydrophila strains in edible fish products cuases a risk to the consumer′s health.

Key words    edible fish product;Aeromonsa. hydrophila;multiplex PCR;aerolysin;haemolysin

嗜水氣单胞菌普遍存在于水环境中，被视为一种机会主义病原体，可以引发人类肠胃炎、伤口感染、败血症以及鱼类的出血性败血症。众所周知，嗜水气单胞菌在鱼类和鱼类产品中流行，因而日常食用的鱼类产品非常容易受到污染，成为传播病原菌的载体。研究表明，食用鱼类产品的气单胞菌感染比例可以达到37.3%～93.0%[1]。气单胞菌属的分离鉴定表明，食用鱼类产品中嗜水气单胞菌是主要的微生物污染源。

嗜水气单胞菌毒性因子包括溶血素、气溶素、蛋白酶、脂酶、DNA酶，这些物质都是引发人类和鱼类疾病的主要发病因子[2]。嗜水气单胞菌不仅可以在最佳生长温度下形成毒性因子，而且在冰箱条件下也可以形成毒性因子。嗜水气单胞菌引发的胃肠炎是最常见的人类疾病。从溶血性肠胃炎患者身上经常可以分离出嗜水气单胞菌，其原因主要是患者食用了受病原体污染的食物或水。

嗜水气单胞菌溶血素属于一大类造孔细菌溶细胞素当中的一种，会导致胞质内容物泄漏，从而破坏细胞膜，最终引发细胞死亡。嗜水气单胞菌目前已经发现存在2种主要的溶血性毒素，包括溶血素和气溶素[3]。气溶素是一种细胞外的可溶性亲水蛋白，表现出溶血特性和细胞溶解特性，可以绑定到真核细胞的特定糖蛋白受体表面，从而形成毛孔。有研究显示， β-溶血性嗜水气单胞菌可以引起广泛存在于兔回肠循环的积液[4]。同时有研究表明，2种β-溶血性嗜水气单胞菌的毒素蛋白都是由具有强毒性的基因负责翻译生产。aerA基因翻译生产的溶血素蛋白广泛存在于产毒素的菌株中。从食物和水分离得到的气单胞菌属菌株通常包含有毒素基因。基于此，本文研究了基因编码的气溶素和溶血素是否存在于人类食用鱼类产品中，并且证实是否属于β-溶血性嗜水气单胞菌，以期为其控制做出比较好的研究基础。

1    材料与方法

1.1    供试菌株

本试验是通过从食用鱼类产品中分离得到β-溶血性嗜水气单胞菌，采用API20NE生化特性对其进行鉴定，样本包括鲤鱼片（n=132）、水（n=6）、鲫鱼片（n=20）、鳟鱼片（n=11）、鲢鱼片（n=20）、鲑鱼片（n=20）和带鱼片（n=20）。对照菌株是嗜水气单胞菌ATCC7965，购买自中国菌种保存实验室。同时采用分离于死蟒蛇的含有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作对照。本实验室分离纯化和保存所有的菌株。

1.2    供试培养基与试剂

培养基和化学品是从上海一基实业有限公司购买获取，PCR试剂盒是从深圳市长征生物科技有限公司购买获取。引物的制备是根据前人描述的方法开展。引物是由大连宝生物工程公司进行合成，具体见表1。

1.3    试验菌株DNA提取

细菌DNA制备过程是根据制造商的产品说明书（北京普洛麦格生物技术有限公司）来开展。

1.4    PCR反应条件

多重PCR反应包括3对引物。PCR反应混合物（25 μL）中包含：12.5 μL Taq酶和1.0 μL ahh1引物，1.0 μL aerA引物，0.2 μL 16S rRNA引物和1 μL提取DNA，余量为双蒸水。

使用PCR仪器（ABI-2720，美国贝登仪器公司）进行扩增，PCR扩增条件：95 ℃初始变性5 min，95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，50个循环，最后72 ℃延伸7 min。

1.5    电泳检测

将扩增的DNA片段放置在2%琼脂糖凝胶进行水平电泳，使用1xTAE缓冲溶液（0.04 MTris，0.02 mol/L醋酸，0.002 mol/L Na2EDTA）、100 V、45 min，使用8 μL PCR产物。

凝胶使用溴化乙锭1 μL/mL进行染色30 min，紫外线光照下观察。

基因标准品是采用100个碱基对的DNA梯度标记物（上海启发试验试剂有限公司），从而对其分子量进行识别。

2    结果与分析

食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌的发病情况如表2所示。经过多重PCR证实，28个β-溶血性嗜水气单胞菌样本都携带有染色体基因16S rRNA。所有嗜水气单胞菌样本（100%）都携带有ahh1基因。26个（93%）的嗜水气单胞菌样本携带有aerA基因。aerA基因不存在于1个（25%）鲤鱼片和1个（17%）带鱼片中（表3）。16S rRNA基因PCR扩增产物（356个碱基对）、ahh1基因扩增产物（130个碱基对）、aerA基因扩增产物（309个碱基对）以及多种食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌的检测结果见图1。

3    结论与讨论

近几年，PCR是用于检测食品微生物病原体的首选方法，主要原因是其具有速度快、高敏感性和特異性等特点[5]。此外，使用特定的毒力基因引物可以将致病性菌株和非致病性菌株区分开。在本研究中，使用特定的引物来证实嗜水气单胞菌气溶素和溶血素基因的存在，并证实这些是主要毒力因子。研究人员普遍认为，气单胞菌属感染的发病机制是多因素和多毒力因子综合作用的结果[6]。一个毒力因子或其中几个的组合可以在不同气单胞菌属中存在并产生相应的毒性。正是如此，还需要更多的研究来区分存在于不同气单胞菌属的几个毒力因子，有助于更好地理解气单胞菌属感染的发病和流行病学机理。因此，在过去的几年中，前人的研究主要集中在溶血素作为气单胞菌属的主要毒力因子。许多研究人员证实溶血性因子是其致病机理，最深入研究的是溶血素和气溶素。

气溶素是溶血性毒素，aerA基因负责编码并起着关键作用，从而引起鱼类感染。气溶素是嗜水气单胞菌致病的主要毒力因子，会导致红细胞溶解，进而致鱼表皮和内脏出血。研究发现，气溶素存在于所有出血性败血病鱼体分离得到的嗜水气单胞菌以及从60%的健康鱼嗜水气单胞菌菌株分离得到[6]。

根据前人研究，一个气单胞菌属菌株可以同时携带编码几个毒力因子的基因[7]。本文研究发现，ahh1基因存在于食用鱼类产品的41%温和气单胞菌和55%嗜水气单胞菌中。aerA和ahh1基因被发现在68%嗜水气单胞菌中存在。此外，即使只有aerA基因，β-溶血性嗜水气单胞菌也表现出细胞毒性特性。不同的是，溶血性温和气单胞菌和非溶血性嗜水气单胞菌没有携带aerA基因。而分离来自于淡水鱼类产品53%的嗜水气单胞菌被发现含有aerA基因。分离来自海洋鱼类分离得到的89%嗜水气单胞菌发现存在气溶素基因aerA和溶血素基因hlyA。同样的研究结果也证实，新鲜的鲑鱼、鳟鱼鱼片和切片以及真空包装的熏制鳟鱼和鲑鱼片中分离得到的嗜水气单胞菌都含有aerA基因，而92%的样本含有hlyA基因[8]。前人研究表明，冷冻鱼分离得到的β-溶血性嗜水气单胞菌株都含有气溶素基因[9]。相反的结果是，寿司、水生生物沙拉、鱼肉酱和虾分离得到嗜水气单胞菌没有发现溶血素基因和气溶素基因[8]。本研究中，β-溶血性嗜水气单胞菌检测结果都含有ahh1基因，而93%的样本含有aerA基因，其中1株从鲤鱼片和1株从带鱼片分离得到的菌株均没有携带aerA基因。

前人研究表明，嗜水气单胞菌污染的鱼和鱼产品都可以引发人体的腹泻[10]。大多数情况下，此类疾病与水产养殖产品或冷藏食品直接食用息息相关。此外，有研究发现，气单胞菌属菌株与其他菌株相比较，同时携带有ahh1和aerA基因的菌株具有更高的细胞毒性滴度[11]，从而证实β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素是一种重要的毒力因子。嗜水气单胞菌的致病性是多因素造成的，可能取决于各种毒性因子的协同效应。在前人研究中，发现所有分离来自鱼的嗜水气单胞菌菌株含有aerA（100%）和分离来自腹泻患者的菌株含有hlyA（83%）基因。溶血素也是人类气单胞菌属感染的发病机理重要组成成分。前人研究表明，从腹泻病人的粪便中分离出6个嗜水气单胞菌菌株都含有β-溶血性ahh1基因，1/2的菌株同时含有气溶素编码基因[12]。

考虑到免疫活性差和免疫力低下的人群越来越多，有可能受到气单胞菌属感染潜在风险，而且广泛的气单胞菌属存在于环境中，长期监测潜在致病性气单胞菌属有助于公众健康。本研究表明，毒性嗜水气单胞菌的PCR鉴定方法相比传统的微生物鉴定方法，非常有用，具有敏感、快速的特点。本研究结果证实，嗜水气单胞菌菌株存在毒力基因編码毒力因子。这些菌株是危险的，有可能导致食物中毒。食用鱼类产品的安全性受到众多因素的影响，包括鱼的来源、鱼的特性和加工方法。新鲜的鱼经过适当的加热进行食用是低风险的，然而如果食用生鱼，不够熟或仅进行简单处理会增加食用风险。食用鱼类产品含有嗜水气单胞菌对人类是危险的，特别是对敏感的人群，例如儿童、老年人和免疫功能不全的人。

本研究证实人类食用的鱼类产品存在β-溶血性嗜水气单胞菌。此外，研究发现，所有这些菌株携带ahh1基因，多数β-溶血性嗜水气单胞菌携带aerA基因，从而证实β-溶血性嗜水气单胞菌溶血素基因和气溶素基因普遍存在于鱼类和鱼类产品中，对消费者的健康造成潜在风险。因此，有必要通过多重PCR检测技术进行快速有效的β-溶血性嗜水气单胞菌的分离鉴定，预防其对人体产生危害。

4    参考文献

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基金项目   福建省科技厅科学研究项目（JK2012012）。

作者简介   余文杰（1977-），男，福建漳州人，硕士，讲师，从事生物科学的教学及科研工作。

收稿日期   2019-02-22