美国山核桃组织培养研究

张文学 印迈 续晨 贲爱玲 蔡小宁

摘  要：以美国薄壳山核桃嫩茎为外植体，研究了硝态氮和不同外源激素组合对其芽诱导和生长的影响。结果表明，硝态氮为美国薄壳山核桃组织培养所必需的，较高含量的细胞分裂素有利于芽的诱导和生长，硝态氮和细胞分裂素BA可增加愈伤组织的数量;适合的芽诱导培养基配方为1/2 B5+NAA 0.1mg/L+BA 2.0mg/L。

关键词：美国山核桃;组织培养;基本培养基;硝态氮

中图分类号  S79文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）11-0022-2

美国山核桃（Carya illinoensis），又名薄壳山核桃、美国薄壳山核桃、碧根果，其果实是一种老少咸宜的坚果食品，深受消费者的欢迎;因其木质坚硬，在家具制作和军工等方面也有一定的应用。开展组织培养技术的研究，可以加快繁殖，更快地推广应用，同时也可以为育种研究提供新的途径。当前，国内外有一些对美国山核桃组织培养的报道[1-4]，但仍然存在诸多问题，需要从更多方面开展研究。为此，笔者开展了基本培养基的硝态氮和外源生长素、细胞分裂素组合对美国薄壳山核桃芽的诱导和生长的影响研究。

1 材料与方法

1.1 材料 美国薄壳山核桃嫩茎。

1.2 培育种子苗 选取大小相对一致的碧根果种子，用37℃自来水浸泡7d左右。待种壳裂开移至沙盆，在28℃恒温培养箱中催芽，在较湿润的条件下培养14d左右，待裂口处伸出白色小芽，然后在装有田间土壤的花盆里播种，3～4d左右小芽出土。

1.3 消毒灭菌 从野外大树上摘取嫩枝，修剪至适当大小后放进烧杯，在自来水下冲洗干净，备用。消毒时先用70%的酒精浸泡20s，倒掉酒精，立即加入灭菌剂。共设置4个处理，分别为：0.1%升汞灭菌5min;0.1%升汞灭菌10min;0.1%升汞灭菌15min;84消毒液灭菌10min。灭菌时间到了后，倒掉灭菌剂，用无菌水冲洗4次，接种于改良WPM添加BA0.5mg/L的培养基上，置25℃，光照时间12h，黑暗时间12h周期下培养。7d后统计外植体污染发生的情况，并将未受动污染的外植体转接到新鲜的培养基上，14d后观察嫩枝外植体存活的情况。

1.4 培养基 基本培养基成分为改良WPM、1/2B5和增减硝态氮，添加不同数量的生长素和细胞分裂素。以上培养基均添加30g/L的蔗糖，用5.6g/L的琼脂粉固化培养基，在灭菌前调整pH至5.9左右，培养基配好后在高压蒸汽灭菌锅中灭菌，121℃保持20min。

1.5 培养室培养条件 培养温度25℃，光照时间12h，黑暗时间12h，如此光暗交替轮换。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对外植体灭菌效果的影响 从表1可知，0.1%升汞灭菌效果好于84消毒液;用0.1%升汞灭菌，随着浸泡外植体的时间加长，灭菌效果越来越好。0.1%升汞灭菌15min的处理虽然灭菌效果最好，但是对薄壳山核桃嫩枝的伤害也最大;既能有较好的灭菌效果，伤害也较小的处理为0.1%升汞灭菌10min。另外，也可以看出，取自野外大树上的嫩枝外植体带菌严重，公认最强的灭菌剂升汞的灭菌效果也难以达到理想状态。考虑到野外获取的薄壳山核桃外植体带菌现象严重，后面的试验从种子直接萌发长大成幼苗，再剪取幼芽，用作组织培养的外植体材料。

2.2 硝态氮和不同外源激素组合对芽诱导和生长的影响 设计了4种不同的培养基配方，1号培养基为1/2B5基本成分+NAA0.1mg/L+BA2.0mg/L;2号培养基为1/2B5基本成分减去硝酸钾+NAA0.1mg/L+BA2.0mg/L;3号培养基为1/2B5基本成分+NAA0.1mg/L;4号培养基为1/2B5基本成分减去硝酸钾+NAA0.1mg/L。上述培养基中都添加了30g/L的蔗糖，用5.6g/L的琼脂粉固化培养基，在培养基灭菌前调整pH为5.8～6.0。从表2可见，芽诱导率最高的是1号培养基，达到100%，其他几种配方差不多。比较1号和2号培养基配方可知，硝酸钾对于芽的诱导是有利的，去除以后，芽的诱导率明显下降。在只添加低浓度的萘乙酸时，是否去除硝酸钾对芽的诱导率影响不大。

从表3可知，薄壳山核桃组培苗的生长需要在培养基中加入一定的细胞分裂素，而且硝态氮也不应缺少。添加BA2.0mg/L同时再添加NAA0.1mg/L，其试管苗的高度优于只添加NAA0.1mg/L的处理，褐化率明显减轻;添加硝酸钾的处理，其试管苗的高度优于减掉硝酸钾的处理，且褐化率明显减轻。此外，产生愈伤组织的多少跟是否添加细胞分裂素和是否减去硝酸钾有关，添加细胞分裂素BA的处理，产生的愈伤组织较多;减去硝酸钾的处理愈伤组织较少。

3 讨论

其他研究者在美国薄壳山核桃的组织培养中曾经选用MS、WPM、DKW基本培养基[1-5]，未见采用B5基本培养基的文献报道。由本次研究结果表明，1/2 B5基本培养基也可以用于美国薄壳山核桃的组织培养。

在前期的试验中，笔者采用MS基本培养基添加不同组合的激素，效果不佳，后改用改良WPM培养基取得了一定进展。考虑到MS基本培养基具有较高含量的硝態氮和铵态氮，可能是试验结果不佳的原因，因而又进一步尝试了1/2 B5基本培养基，此基本培养基的特点是含有很低量的铵态氮和比MS基本培养基适当降低含量的硝态氮。实验证明，将1/2B5基本培养基中硝态氮去除，明显不利于芽的诱导和愈伤组织生长。如果将铵态氮去除会发生什么情况，今后有待于进一步研究。

此外，培养基中的细胞分裂素含量与生长素含量比例也很重要，较高比例的细胞分裂素含量显然有利于美国山核桃芽的诱导和生长。在另外的试验中，我们曾经将NAA含量由0.1mg/L提高到0.5mg/L，BA含量维持在2.0mg/L，结果继代培养的试管苗均褐化死亡，说明NAA含量不宜过高，或许NAA含量可以更低甚至为0，这有待于后续实验证实。

参考文献

[1]董筱昀，蒋泽平，蒋春，等.薄壳山核桃试管离体培养中不定芽诱导及增殖技术的研究[J].江苏林业科技，2013，40（3）：10-14.

[2]吕运舟，董筱昀，蒋泽平，等.不同无性系薄壳山核桃播种苗的组织培养[J].江苏农业科学，2017，45（1） ：47-49.

[3]吕运舟，窦全琴，蒋泽平.薄壳山核桃愈伤组织诱导的影响因素[J].江苏林业科技，2015，42（5）：29-32.

[4]Mathews H，Wetzstein H Y. A revised protocol for efficient regeneration of somatic embryos and acclimatization of plantlets in pecan （Carya illinoensis） [J].Plant Science，1993，91（1） ：103-108.

[5]纪小楠.三种山核桃属植物组织培养技术研究[D].长沙：中南林业科技大学，2009.

（责编：张宏民）