银耳、木耳多糖清除羟自由基的比较实验*

生命科学学院，山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

银耳(Tremella)又名白木耳、雪耳，属于隔担子菌亚门银耳科。银耳在我国具有悠久的食用和药用历史，含有碳水化合物、蛋白质、维生素和多种氨基酸等。目前研究最多的是银耳多糖。银耳多糖(Tremella polysaccharides，TP)是重要的生物活性物质，可以通过激活免疫细胞来提高机体的免疫功能,使吞噬细胞吞噬能力提升，增加淋巴细胞活性从而提高其功能[1-3]，抗肿瘤[4]、预防肠道疾病[5-7]等功效。

引起机体衰老的主要原因是细胞代谢过程中不断产生的自由基[8]。羟基是一种氧化能力很强，危害最大的一种自由基[9]。研究发现，木耳多糖对各种活性氧均具有抗氧化作用[10]。颜军等[5]提取的银耳多糖对羟自由基有清除作用，活性较好，并且去除效果良好，而且随着多糖浓度的升高清除率增大。刘培勋、高小荣等用碱提银耳多糖对羟基自由基的清除结果证实：对Fenton反应体系所产生的羟基自由基多糖纯品相对于甘露醇的清除效果好[11]，以溶液浓度较高的作用最强。

本实验拟提取银耳、木耳多糖，用木耳进行对照[12]，对多糖清除羟基自由基的抗氧化活性进行对比分析，为多糖的功能研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

低速冷冻离心机(D5KR 东旺)，FZ102型高速粉碎机(泰斯特)，A005电子天平(乐祺)，HH.W21-600型恒温水浴锅(北京中兴)，722型可见分光光度计(上海恒平)，DHG-9203A型真空干燥箱，LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌锅，V-1100D型可见分光光度计(上海美谱达)，RE2000A型旋转蒸发器(上海亚荣)。

1.2 药品与试剂

银耳，木耳，果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶，蒽酮、过氧化氢、硫酸亚铁、氯仿、正丁醇、乙醇和水杨酸均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1多糖的提取分离

(1) 酶解法提取银耳多糖。准确称取无杂质干燥银耳子实体6.0 g，根据鲍会梅[13]的方法，称量、研磨：精确称取无杂质干燥银耳子实体6.0 g 1份，在研钵里研磨充分，按1∶70的料液比加水420 mL，用1000 mL大烧杯在室温下(20～25℃)浸泡30 min，制成银耳浆液；再精确称取无杂质黑木耳子实体干品5.0 g，按1∶80的料液比加水400 mL，在室温下(20～25℃)浸泡30 min，制成木耳浆液，过滤浓缩至糖浆状100 mL左右。

(2)去除多余蛋白。加入1/4体积(25 mL)的氯仿-正丁醇后轻微震荡混匀使之反应充分，等待0.5 h后观察有明显的分层现象，用分液漏斗分出下层有机层和变性蛋白质层，剩余的多糖提取液从上口倒出，重复去蛋白操作2次。

(3)乙醇析出。上层溶液经2 mol/L氢氧化钠把pH调到7，水浴将上层溶液蒸发2/3，然后添加体积分数为95%乙醇3倍，使之充分混合，在放置2 h后，多糖在容器底部下沉，离心(3000 r/min 15 min)使沉淀物分开，弃去上清液。用无水乙醇清洗沉淀物1次，之后将沉淀转移至平板放入电热恒温鼓风干燥箱干燥10 h左右得到银耳多糖粗品，将得到的多糖粗品放置阴凉干燥处保存。

1.3.2多糖含量的测定

(1) 蒽酮试液的制备。精确称取蒽酮0.20 g，加入100 mL浓硫酸溶解即得蒽酮试液。现配现用，置于4℃放置，存放于棕色瓶中。

(2)葡萄糖标准曲线的制备。配置系列浓度梯度葡萄糖标准溶液：0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mg/mL，每个标准液中加入6 mL的硫酸蒽酮试液，沸水浴10 min，置于冷水中15 min，在620 nm波长下测定吸光度。以葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

(3)蒽酮-硫酸比色法测定样品的吸光度。取2 mL的浸提液置于相应的具塞试管中，每个具塞试管加入6 mL的硫酸蒽酮试液。静置放凉后沸水浴10 min，取出后置于冷水中15 min。设置空白对照，在620 nm处测吸光度，记录样品溶液的吸光光度值，并根据公式计算出不同条件下浸提液中所含有的银耳多糖的浓度，绘出相应曲线。

1.3.3多糖清除羟自由基作用的测定

(1) 制备不同浓度的银耳多糖溶液。0.5 mg/mL：精确称取3 mg多糖加入6 mL去离子水溶解；1.5 mg/mL：精确称取9 mg多糖加入6 mL去离子水溶解；3.0 mg/mL：精确称取18 mg多糖加入6 mL去离子水溶解。

(2) 过氧化氢-亚铁离子-甲基紫反应体系的配置。按顺序在试管中加入硫酸亚铁、水杨酸、去离子水和过氧化氢等化学试剂，零管溶液为无过氧化氢的反应体系，晃动使体系中溶液反应完全，在510 nm处测量吸光值A0。

(3) AX、AX0的测定(A0为空白对照的吸光值，AX为加样品的吸光值，AX0为不加显色剂过氧化氢)。按顺序在试管中加入硫酸亚铁、水杨酸、不同质量浓度的银耳多糖溶液(0.5 mg/mL、1.5 mg/mL、3.0 mg/mL)、去离子水，最后加入过氧化氢启动反应，并摇匀使其反应充分,参比溶液为去离子水。

每种溶液的添加体积如表1所示，将9 mmol /L硫酸亚铁,9 mmol/L 乙醇-水杨酸[14]按照先后顺序添加至试管中，添加一定量的去离子水，最后添加8.8 mmol/L过氧化氢开始反应，在37℃水浴锅中加热，15 min后，进行吸光度A0、AX和AX0的测量。A0测量时，参比溶液是一个无双氧水的体系。AX和AX0测定时，参比溶液是去离子水。

以同样方法制备0.5 mg/mL、1.5 mg/mL、3 mg/mL的黑木耳多糖溶液备用。

表1 银耳多糖抗氧化反应各试剂添加量(mL)

1.3.4木耳多糖清除羟自由基的反应

每种溶液的添加体积如表2所示，将9 mmol/L硫酸亚铁、9 mmol/L乙醇-水杨酸按照先后顺序添加至试管中，然后添加一定量的去离子水，最后添加8.8 mmol/L H2O2开始反应,在37℃水浴锅中加热，15 min后，进行吸光度A0、AX和AX0的测量。A0测量时，参比溶液是一个无双氧水的体系，AX和AX0测定时，参比溶液是去离子水。

表2 黑木耳多糖抗氧化反应各溶剂添加量(mL)

1.4 数据处理

运用SPSS24.0软件进行数据分析。

2 结 果

2.1 标准曲线的绘制

不同浓度的葡萄糖溶液在620 nm处的吸光光度值见表1。以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制相应的标准曲线(图1)，所测得的标准曲线方程为：y=3.3271x-0.0057(相关系数R2=0.9888)。

2.2 银耳多糖与黑木耳多糖的提取率计算

根据朗伯-比尔定律：A=lg(1/T)=Kbc(A为吸光光度值；T为透射比，是投射光强度与入射光强度的比值；K为摩尔吸收系数；c为吸光物质的浓度；b为吸收层厚度，为1 cm。)，变化公式即可求得银耳多糖的浓度c，由c进而求得银耳多糖的质量。提取率=银耳多糖的提取量/银耳的重量。

实验准确称取无杂质银耳子实体干品6.0 g，经过高温高压蒸煮、浓缩、除杂蛋白、醇析和干燥以后得到银耳多糖粗品0.835 g，提取率为13.92%；准确称取无杂质黑木耳子实体干品5.0 g，经过提取得到黑木耳多糖粗品0.654 g，多糖提取率为13.08%。

表3 不同浓度的葡萄糖溶液在620nm处的吸光光度值

图1 不同浓度的葡萄糖溶液下吸光光度值标准曲线

2.3 清除率的计算

2.3.1银耳多糖清除率计算及相关曲线的绘制

根据公式清除率S=(A0-AX+AX0)/A0×100%计算，结果见表4。以一定浓度梯度的银耳多糖溶液为横坐标，以清除率为纵坐标绘制曲线，曲线方程为：y = 10.282x + 4.2432，R2= 0.9881，见图2。

由表4及图2可知，随着银耳多糖浓度的的升高，银耳多糖清除羟基自由基能力逐渐增强，0.5 mg/mL、1.5 mg/mL、3.0 mg/mL的银耳多糖的羟基清除率分别为10.36%、18.04%、35.74%。

表4 银耳多糖对羟自由基的清除作用

图2 银耳多糖对羟自由基的清除作用

2.3.2黑木耳多糖清除率计算及相关曲线的绘制

根据公式清除率S=(A0-AX+AX0)/A0×100%计算，结果见表5。以一定浓度梯度的黑木耳多糖溶液为横坐标，以清除率为纵坐标绘制曲线，曲线方程为：y = 13.267x + 13.441，R2= 0.9743，以一定浓度梯度的黑木耳多糖溶液为横坐标，以清除率为纵坐标绘制曲线，见图3。

由表5及图3可知，随着黑木耳多糖浓度的增加，其羟基清除率在逐步增加，当黑木耳多糖浓度为0.5 mg/mL、1.5 mg/mL、3.0 mg/mL时其清除率分别为18.21%、36.45%、52.00%。

表5 黑木耳多糖吸光度及清除率

图3 黑木耳多糖对羟自由基的清除作用

2.4 对比分析

银耳多糖与黑木耳多糖对羟自由基都有清除作用，而且两种多糖的清除效果相对比较明显，且经计算木耳半数清除浓度为2.75 mg/mL，小于银耳多糖的半数清除浓度，故银耳多糖的清除作用与黑木耳多糖相比较弱。刘培勋、高小荣等用碱提银耳多糖对羟基自由基的清除结果证实：对Fenton反应体系所产生的羟基自由基多糖纯品均相对于甘露醇的清除效果好，当中以溶液浓度较高的作用最强[10]。

银耳多糖在0.5～3.0 mg/mL的浓度范围内对羟基自由基清除率最大为35.74%，黑木耳多糖在相等浓度范围内为52%；根据实验结果分析可推测：银耳多糖与木耳多糖的清除率可随多糖的浓度升高而增大。

3 讨 论

分析发现，银耳多糖与黑木耳多糖对羟自由基清除效果差异具有统计学意义(P=0.035)。经计算木耳半数清除浓度为2.75 mg/mL，小于银耳多糖的半数清除浓度，故银耳多糖的清除作用与黑木耳多糖相比较弱。相比于白晨等[15]设计的实验，本实验采用95%乙醇沉淀多糖，无水乙醇清洗，提高了多糖的纯度且通过黑木耳多糖对比，得出银耳多糖的清除率小于木耳多糖对羟基的清除率。