肺癌患者血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141的表达及临床意义

邓超，谭建军，朱川，黄小平，任必勇，吴佼佼，黄羽

重庆三峡中心医院肿瘤科，重庆4041000

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，其病理类型包括腺癌、鳞癌和小细胞癌等，其中腺癌在所有类型肺癌中所占比例呈上趋势[1]。流行病学研究表明，肺癌的发病率和病死率居中国恶性肿瘤的首位[2]。目前临床肺癌的治疗方法多为手术及放化疗等，但效果有限。近几年，随着分子生物学研究的深入，肿瘤的靶向治疗策略被提出，该治疗方法具有针对性强、不良反应少等优点。Cheng等[3]的研究显示，将antimiRNA靶向输送至酸性肿瘤微环境后，其可通过抑制miRNA-155表达，抑制肿瘤进展。研究表明，miRNA-200家族控制与乳腺癌、结直肠癌等多种肿瘤转移密切相关的上皮-间充质转化过程，可能成为多种肿瘤的诊断标志物[4-5]。另外，血清中miRNA方便提取且极易检测，miRNA可能成为诊断肺癌的生物标志物，也可能成为肺癌靶向治疗的靶点。本研究选取miRNA-200家族中具有代表性的miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141进行研究，旨在通过评估肺癌患者血清中miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的表达水平，明确miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141诊断肺癌的价值，探讨血清miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141水平与肺癌患者临床特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年11月至2014年12月于重庆三峡中心医院诊治的肺癌患者。纳入标准：①接受了肿瘤减灭术治疗；②经术后病理活检确诊为原发性肺癌，且为初诊病例；③临床及随访资料完整。排除标准：①有其他原发肿瘤；②合并其他重要器官功能障碍。根据纳入、排除标准，共纳入96例肺癌患者（肺癌组），其中男45例，女51例；年龄为24～78岁，平均年龄为（50.47±10.23）岁；小细胞肺癌25例，肺腺癌19例，肺鳞状细胞癌42例，其他10例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲa期65例；肿瘤直径：＞3 cm 59例，≤3 cm 37例；有淋巴结转移51例，无淋巴结转移45例。选取同期95例健康体检者作为健康对照组，其中男46例，女49例；年龄为22～79岁，平均年龄为（51.89±11.72）岁。两组受试者的年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂与仪器

Trizol RNA提取试剂购自日本Takara公司，MystiCq®miRNA实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒、mirPremier®miRNA分离萃取试剂盒均购自美国Sigma公司，荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海生工生物公司合成，荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 检测方法

采用qRT-PCR检测肺癌患者和健康体检者的血清miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的表达情况。Trizol法提取血清总RNA，采用反转录试剂盒反转录获得cDNA。采用定量PCR仪对miRNA-200b、miRNA-200c和 miRNA-141进行扩增。反应体系：正、反引物（10µmol/l）各0.5µl，聚合酶和绿色荧光染料的预混液5.0µl，cDNA（50 ng/µl）1.0µl，qRT-PCR试剂盒中水3.0µl，共10µl。反应条件设置如下：95℃ 90 s，95℃ 30 s，62℃30 s，72℃20 s，共40个循环。反应结束后，采用2-ΔΔCT法对 miRNA-200b、miRNA-200c和 miRNA-141在不同血清样品中的相对表达量进行分析。以U6为内参，qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 观察指标

比较两组患者miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的相对表达量，并采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清 miRNA-200b、miRNA-200c和 miRNA-141对肺癌的诊断效能，及其与肺癌患者的临床特征[性别、年龄、吸烟情况、病理类型、肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移情况、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、细胞角质蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）、神经元特异性稀醇化酶（neuron specific enolase，NSE）]及预后的关系。

1.5 随访

所有肺癌患者均接受了门诊复诊或电话随访，每月1次，随访截止时间为2017年11月30日。随访终止事件：患者死亡。随访期间无患者失访。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，生存分析采用Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141相对表达量的比较

肺癌组患者血清miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的相对表达量均明显低于健康对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表2 两组受试者血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141相对表达量的比较（±s）

表2 两组受试者血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141相对表达量的比较（±s）

组别健康对照组（n=95）肺癌组（n=96）t值P值miRNA-200b 1.02±0.21 0.75±0.15 10.233 0.000 miRNA-200c 1.01±0.19 0.79±0.16 8.659 0.000 miRNA-141 1.05±0.22 0.64±0.13 15.699 0.000

2.2 血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141诊断肺癌的ROC曲线分析

miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141诊断肺癌的ROC曲线下面积分别为0.749（95%CI：0.672～0.865，P＜0.05）、0.746（95%CI：0.669～0.853，P＜0.05）、0.827（95%CI：0.718～0.932，P＜0.05），分别取 miRNA-200b=0.84、miRNA-200c=0.89、miRNA-141=0.75为截断值，其灵敏度分别为78.15%、54.71%、84.13%，特异度分别为68.41%、84.65%、75.32%。（图1～3）

图1 血清miRNA-200 b诊断肺癌的ROC曲线

图2 血清miRNA-200 c诊断肺癌的ROC曲线

图3 血清miRNA-141诊断肺癌的ROC曲线

2.3 不同临床特征肺癌患者血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141表达情况的比较

分别以0.84、0.89、0.75为截断值，将肺癌患者分为miRNA-200b低表达（≤0.84）59例、高表达（＞0.84）37例，miRNA-200c低表达（≤0.89）53例、高表达（＞0.89）43例，miRNA-141低表达（≤0.75）63例、高表达（＞0.75）33例。不同TNM分期的肺癌患者血清miRNA-200b、miRNA-200c的表达情况比较，差异均有统计学意义（χ2=7.367、5.040，P＜0.05）；不同病理类型、SCC水平的肺癌患者血清miRNA-141的表达情况比较，差异均有统计学意义（χ2=17.176、16.221，P＜0.01）；不同性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径、淋巴结转移情况、CEA水平、CYFRA21-1水平、NSE水平的肺癌患者血清miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同病理类型、SCC水平的肺癌患者血清miRNA-200b、miRNA-200c表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同TNM分期的肺癌患者血清miRNA-141表达情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 不同临床特征的肺癌患者血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141的表达情况

表3 （续）

2.4 血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141相对表达量对肺癌患者预后的影响

随访3年，96例肺癌患者中生存37例，占38.54%。miRNA-200b高表达患者的3年生存率为62.16%（23/37），高于miRNA-200b低表达患者的23.73%（14/59）（χ2=14.180，P＜0.05）；miRNA-200c高表达患者的3年生存率为58.14%（25/43），高于miRNA-200c低表达患者的 22.64%（12/53）（χ2=12.629，P＜0.05）；miRNA-141高表达患者的3年生存率为63.64%（21/33），高于miRNA-141低表达患者的25.40%（16/63）（χ2=13.369，P＜0.05）。（图4～6）

图 4 miRNA-200 b低表达患者（ n=59）与高表达患者（ n=37）的 3年生存曲线

图5 miRNA-200 c低表达患者（ n=53）与高表达患者（ n=43）的 3年生存曲线

图6 miRNA-141低表达患者（ n=63）与高表达患者（ n=33）的 3年生存曲线

3 讨论

肺癌是威胁人们身体健康和生命安全的常见恶性肿瘤。随着诊疗技术的提高，肺癌的治疗效果进一步提高，但其5年生存率仍不理想[6]。根据第8版肺癌TNM分期建议，从早期肺癌（Ⅰa～Ⅱb）进展至中晚期（Ⅲa～Ⅲc）的过程中，患者60个月生存率从55%～90%下降至12%～41%，中晚期肺癌治疗难度极大，病情凶险，易复发，病死率高[7]。不良的生活习惯、环境因素及遗传易感因素等均可能导致肺癌的发生，但其具体的发病机制尚不清楚。因此，研究肺癌的发生发展机制，寻找与肺癌发生发展相关的生物标志物，可为肺癌早期诊断、后期靶向治疗及改善患者预后提供新的思路。

miRNA是真核生物细胞内由18～25个核苷酸组成的一类内源性单链非编码RNA，具有高度保守性，能与靶基因miRNA非编码区特异性结合，调节靶点基因沉默、蛋白质表达抑制等，在细胞增殖、细胞分化及细胞凋亡等生物学过程中发挥非常重要的作用[8]。miRNA的异常表达在包括肺癌等多种疾病的发生发展中发挥重要的作用，在多种疾病中作为重要调节因子参与疾病发生[9]。miRNA相对分子质量十分小，可以穿过细胞膜进入血液中，在血清或血浆中均匀分布，相对稳定且极易被检测[10]。鉴于这些特点，血清miRNA可以作为多种疾病诊断的潜在生物标志物，具有较好的应用前景。然而，目前关于肺癌患者血清miRNA表达模式的研究相对较少。

miRNA-200家族是一类常见的哺乳动物miRNA之一，存在于多种细胞、组织中，包括miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141等[11]。研究表明，miRNA-200家族主要参与调节上皮-间充质转化过程，调节细胞分裂和凋亡，调节肿瘤干细胞的自我更新和分化过程，逆转肿瘤细胞的化疗耐药性，不仅在机体正常发育过程中起着重要的作用，而且在包括恶性肿瘤在内的多种疾病中也普遍存在失调[12]。Liu 等[13]发现，miRNA-200c在膀胱癌组织和细胞中的表达显著下调，过表达miRNA-200c可显著降低膀胱癌细胞的侵袭、迁移和增殖能力，提示miRNA-200c可能作为抑癌因子参与膀胱癌发展。Manavalan 等[14]研究表明，miRNA-200b、miRNA-200c在乳腺癌细胞系LY2细胞中的表达下调，过表达miRNA-200b或miRNA-200c可改变细胞形态，抑制细胞迁移，降低细胞对雌激素受体拮抗剂的敏感性，提示miRNA-200b、miRNA-200c可能作为乳腺癌治疗的生物靶点。另外，Xu等[15]在前列腺癌组织和细胞系检测中发现，miRNA-141表达水平低，miRNA-141过表达显著抑制前列腺癌细胞的生长和侵袭，促进细胞凋亡，提示miRNA-141在前列腺癌进展过程中发挥重要的作用，可能成为前列腺癌诊断和治疗的靶点。Nishijima等[16]发现，miRNA-200b、miRNA-141在肺癌细胞中的表达下调，过表达miRNA-200b可扭转肺癌细胞的耐药性。基于以上研究结果，本研究推测miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141可能参与肺癌的发生和进展，但其在肺癌发生、进展中的作用尚不清楚。因此，本研究检测了miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141在肺癌患者血清中的表达情况，结果显示，肺癌组患者血清miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的相对表达量均明显低于健康对照组。这与miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141在膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌中的表达情况一致[13-15]，表明 miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的表达下调可能是肺癌发生的原因之一。ROC曲线分析显示，miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141诊断肺癌的曲线下面积分别为0.749、0.746和 0.827，表明 miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141对肺癌患者和健康体检者有较强辨别诊断效能，提示检测血清miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141可用于肺癌的初步筛查，且miRNA-141的诊断效能更强。进一步分析表明，血清miRNA-200b、miRNA-200c的表达情况与肺癌患者TNM分期有关，Ⅲa期患者血清miRNA-200b、miRNA-200c低表达的比例分别为70.77%（46/65）、63.08%（41/65），分别高于Ⅰ～Ⅱ期患者的 41.94%（13/31）、38.71%（12/31）。TNM 分期可反映肿瘤的恶性程度，分期越高，肿瘤的恶性程度越高，提示miRNA-200b、miRNA-200c可能参与肺癌的进展，其表达情况与肿瘤的恶性程度有关。本研究显示，血清miRNA-141的表达情况与肺癌患者的病理类型和SCC水平有关（P＜0.01）。另外，本研究发现，miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141低表达患者的3年生存率均分别低于miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141高表达患者，提示miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141表达与肺癌患者3年生存率有关，低表达的肺癌患者预后不良，推测 miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141可作为评估肺癌患者预后的生物标志物。然而 miRNA-200b、miRNA-200c和 miRNA-141参与肺癌发生、发展的具体机制有待进一步证实，将在后续研究中进行分析。

综上所述，miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141在肺癌患者血清中的相对表达量较低，对肺癌具有较高诊断价值，与肺癌患者3年生存率有关，推测miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141可能作为抑癌因子参与肺癌疾病进程，为肺癌的精准治疗提供了新的思路。