枳菊解郁汤对小鼠抑郁样行为的改善作用及其机制

张璐瑶　鲍艺今　李文璇　范明才 张津铭　李亚

【摘 要】目的：研究枳菊解郁汤对慢性不可预见性温和应激（CUMS）小鼠抑郁样行为的作用及其机制。方法：采用CUMS方式28天建立抑郁小鼠模型，灌胃枳菊解郁汤，通过开场、悬尾实验检测小鼠抑郁样行为变化;并且检测小鼠前脑皮层海马血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果：与对照组比较，模型组小鼠的水平活动度和自发活动明显减弱，总僵住不动时间明显延长;小鼠海马及前脑皮层VEGF表达水平明显降低;枳菊解郁汤连续灌胃28后，各剂量组和氟西汀组小鼠比模型组各检测指标均得到明显逆转。枳菊解郁汤中剂量组效果显著。结论：中药枳菊解郁汤可通过调控VEGF水平改善CUMS小鼠的抑郁样行为。

【关键词】枳菊解郁汤;慢性不可预见性应激;抑郁样行为;VEGF

中图分类号：Q427 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）13-0079-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.13.036

Improvement and its Mechanism of Chinese Medicine Zhijujieyu-tang on Depression-like Behavior in Mice

ZHANG Lu-yao BAO Yi-jin LI Wen-xuan FAN Ming-cai ZHANG Jin-ming LI Ya

（School of Life Sciences，Qufu normal University，Shandong Qufu 273165，China）

【Abstract】Objective： To investigate the improvement and its mechanism of Zhijujieyu-tang on depression-like behaviors of chronic unpredictable mild stress （CUMS） mice，.Methods： The depression-like mice model was established by CUMS for 28 d.Zhijujieyu-tang and fluoxetine were intragastrically given to the mice.The depression-like behaviors were tested using the open field and tail suspension test. The changes of the Vascular endothelial growth factor （VEGF） in the hippocampus （HP） and prefrontal cortex （PFC） were evaluated by immunohistochemistry. Results： Compared with the control group， the exploration and spontaneous activity were significantly reduced， the immobility time were significantly increased， and the levels of VEGF contents in HP and PFC were apparently decreased in model group.After the mice were treated with fluoxetine and Zhijujieyu-tang， all the above indicators were significantly reversed. Zhijujieyu-tang medium dose group mice showed that it significantly effective. Conclusions： Zhijujieyu-tang improves behaviors of depressed model mice by modulating VEGF in HP and PFC.

【Key words】 Zhijujieyu-tang; CUMS; Depression-like behaviors; VEGF

研究表明，抑郁症患者表现出情绪低落、行为绝望和认知功能障碍等主要症状，严重威胁着人类的健康。枳菊解郁汤是本课题组经单味药精选、药效筛选等得到的中药复方，前期初步的研究结果表明，复方枳菊解郁汤具有一定的抗抑郁作用[1]，但其进一步的效果以及作用机制还需进一步探讨。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管活性因子家族中的一员，能够刺激血管内皮细胞增殖和血管形成。研究发现，VEGF在中枢神经系统有丰富的表达[2]，可以作为脑组织中的一种神经因子，营养、保护神经元，并且能够抑制细胞凋亡[3]。抗抑郁药物能够促使VEGF的表达， VEGF与抑郁症的发生密切相关，可以成为抑郁症的生物学标志[4]。本研究中，我们在以往研究的基础上，采用慢性不可预见性应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）制备抑郁模型小鼠，灌胃不同剂量的枳菊解郁汤，检测小鼠前脑皮层海马VEGF的表达。以探讨枳菊解郁对小鼠抑郁樣行为的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

昆明品系小白鼠，2月龄，SPF级，雌雄各半，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证号：SCXK（鲁）20140007。动物自由进食，饮水，在自然光暗周期动物环境饲养。

1.2 实验药品和使用方法

中药复方枳菊解郁汤：枳实10g、石菖蒲15g、夜交藤20g、胆星10g、郁金15g、炒枣仁30g、勾藤30g、菊花15g、柏仁30g。依据我们实验室先前的研究进行[5]，按人鼠等效剂量换算（生药量175g），每日在应激前1小时给相应小组灌胃，每只小鼠0.2 ml。盐酸氟西汀：按照人鼠等效剂量换算，3.6mg/kg.d，灌胃，每只小鼠0.2ml[5]。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组和CUMS模型小鼠的建立

随机将小鼠分为对照组，模型组，西药阳性对照组（氟西汀 3.6mg/kg.d）、枳菊解郁汤高剂量（四倍浓度）组，中剂量（二倍浓度）组，低剂量（等量浓度）组，每组10只。CUMS方式包括7种不重复的方式应激，包括：斜笼（24h），电击足底，：在实验箱中，每天电刺激15次，每一次10秒，刺激电压36V;通宵照明（产生明暗的颠倒），冷水刺激（8℃冷水，共计3min），禁食（24h），高台：将小鼠放置在铁架台上高160cm，每天1h;禁水（24h）。依据我们先前的研究工作进行[5]。每天随机一种，使应激具有不可预见性，共持续28天。

1.3.2 开场实验（open-field test）

开场实验箱是底部5×5=25cm个正方形格子，将小鼠置于开场中央区，开始计时5min，观察小鼠的水平活动、垂直活动等，在周边格走动和中央格走动的状态时间等。记录直立次数（两前爪抬起来远离地面的次数）、穿越格数（四个爪完全进入下一个格内，为跨越一个水平格）、中央格停留时间。

1.3.3 悬尾实验（tail suspension test）

实验时，将小鼠尾端2cm处固定在试管夹上，小鼠头顶部距离箱子底部10cm，开始计时6min，需要记录的指标为：第一次静止不动时间（不动潜伏期）：从开始悬挂计时至小鼠静止不动;后4min小鼠累计不动时间。

1.3.4 小鼠各脑区神经元形态学变化及 VEGF的表达

Morris水迷宫实验完成后，0.4%的戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠，灌流取脑，经过常规的后固定，按通用的程序进行，最后做冠状切片（片厚5μm）。用于免疫组織化学（SABC法）染色。VEGF免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。取已制备完成的小鼠海马各区及PFC切片，通过Olympus BX-51显微镜，在放大倍数为400倍的视野内，进行显微拍照保存;利用图像分析计算小鼠海马和PFC的VEGF平均目标灰度值。

1.4 统计学数据分析

数据均采用平均数±标准误（M±SE）。开场实验、悬尾实验和VEGF表达水平采用两因素方差分析（two-way ANOVA），并以Bonferroni进行多重差异比较，及非配对t检验。统计学显著性差异用P<0.05来表示。

2 结果

2.1 开场实验结果

各组小鼠开场实验结果显示（表1）：相比于对照组，模型组小鼠的直立次数、穿越格数显著减少（P<0.01，P<0.01），中央格停留时间显著增多（P<0.01），表明在经过了28天的CUMS处理以后，模型组小鼠在新环境下的探究行为、自发活动明显减少。相比于模型组，使用西药氟西汀，及中药灌胃28天以后，枳菊解郁汤各剂量组的开场行为指标均有显著变化。

2.2 悬尾实验结果

各组小鼠悬尾实验结果显示（表2）：相比于对照组小鼠，模型组小鼠的不动潜伏期显著减少（P<0.01），而后4min累计不动时间显著增加（P<0.01）;相比于模型组小鼠，中药中剂量灌胃28天以后，小鼠的不动潜伏期显著增加（P<0.05，P<0.01）;其他各剂量组小鼠也增多，但无显著性差异;后4min累计不动时间，氟西汀组、枳菊解郁汤中剂量组小鼠均显著减少（P<0.01，P<0.01），显示出明显的抗抑郁作用。

2.3 各组小鼠各脑区VEGF的表达

模型组小鼠VEGF阳性细胞平均目标灰度值在海马和PFC 明显增加（表3）（P<0.01，P<0.05）。相比于模型组小鼠，氟西汀、中药中剂量灌胃28天以后，氟西汀组和中剂量组小鼠VEGF目标灰度值明显降低（P<0.01，P<0.05）;表明氟西汀组和中剂量组小鼠VEGF在海马和PFC的表达增强。

3 讨论

VEGF家族有7个成员，是血管形成重要的调控因子，主要是血管内皮细胞，但对于神经系统的发育也是必不可少的。在脑内海马齿状回有高表达，可能直接促进了神经细胞的增殖。在对新型抗抑郁药物的研发及探索其作用机理的研究中，发现抗抑郁药物可增加海马的VEGF 水平和内皮细胞增殖，提示抗抑郁药物在海马的作用途径;如果使用特异性的抑制剂阻断VEGF的水平，可以发现海马的神经发生消失，抗抑郁作用也减弱[8]。

在本实验中，CUMS应激方式建立小鼠抑郁动物模型。结果显示建模较成功，而中药枳菊解郁汤能明显增加小鼠对新异环境的活动度，可改善抑郁模型小鼠的绝望情绪增加，起到一定的抗抑郁效果，且枳菊解郁汤中剂量组效果更明显。本研究结果表明，连续给药枳菊解郁汤处理28天，表现出明显提高VEGF的表达水平，以减弱脑内海马和前脑皮层神经元的功能减退。因此，可以推测CUMS导致的抑郁样行为可能与前脑皮层和海马VEGF表达降低密切相关，而中药枳菊解郁汤可通过调控VEGF水平改善小鼠的抑郁样行为。

【参考文献】

[1]杜娜，陈倩，李洋，肖婧珊，姚梦姣，李亚.中药复方对抑郁模型小鼠学习记忆能力及脑内SDF-1的影响[J].科技视界，2015（3）：16-17.

[2]Yasuhara T， Shingo T， Date I.The potential role of vascular endothelial growth factor in the central nervous system [J].Rev Neurosci， 2004， 15： 293-307，

[3]Marta Maria Nowacka， Ewa Obuchowicz. Vascular endothelial growth factor（VEGF）and its role in the central nervous system： A new element in the neurotrophic hypothesis of antidepressant drug action[J].Neuropeptides， 2012，46：1-10.

[4]Bergstrom A，Jayatissa MN，MOrk A，et a1.Stress sensitivity and resilience in the chronic mild stress rat model of depression; an in situ hybridization study[J].Brain Res.2008;1196：41-52.

[5]杜娜.枳菊解郁汤对抑郁模型小鼠的抗抑郁作用及其神经机制[D].山东：曲阜师范大学，2015：21-32.

[6]佗婷婷，冯正直，蒋娟等.FGF-2 和VEGF 在慢性应激抑郁大鼠前额叶皮层表达[J].第三军医大学学报，2012，34（13）：1265-1268.