干扰素γ对人羊膜间充质干细胞的增殖及炎性因子分泌的影响

许影 高雅 杨春燕 朱东茂 张银田 李威儒 平宝红

南方医科大学南方医院1惠侨医疗中心，2血液科（广州510515）

干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）主要由自然杀伤细胞（nature killer cells，NKs）和活化的T 细胞分泌，具有免疫激活、诱导免疫耐受、调节免疫抑制的功能［1］。IFN-γ 是促炎性因子中重要成分，在炎症性疾病尤其移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）病理发生、发展过程中发挥核心作用［1-2］。IFN-γ可通过诱导吲哚胺2，3-二氧化酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）途径调节免疫细胞的适应性或固有性免疫反应，也可调节间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）的免疫功能［1，3］。

MSCs 发挥免疫调节作用需要炎症微环境中IFN-γ的激活［3］。IFN-γ预处理的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stromal cells，BMMSCs）不仅上调IL-6、IL-8 等炎症抑制因子表达及分泌［4］，而且IFN-γ激活的BMMSCs 显著预防和抑制GVHD 的发生、进展［5］。目前临床防治GVHD 的MSC 主要来源于骨髓［6］，但BMMSCs 的临床应用面临许多挑战，如采髓有创伤性，细胞活力受供者年龄等因素影响［4］。人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cell，hAMSC）来源于健康孕妇剖宫产后废弃物——胎盘羊膜，易于获得，数量丰富。免疫表型鉴定表明，hAMSCs与BMMSCs相似，具有免疫调节特性，hAMSCs 比BMMSCs 有更强的增殖能力及干细胞特性，可能为GVHD 的防治提供一种新的种子细胞来源［7-9］。但目前IFN-γ对hAMSCs 的生长、增殖以及免疫调节的影响少有报道。因此，本研究拟在hAMSCs 培养基中加入不同浓度IFN-γ，分析IFN-γ对hAMSCs 的增殖能力、凋亡情况及炎性因子分泌的影响，为GVHD 防治提供一个新策略。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂

1.1.1 胎盘组织 共两份，均经知情同意，获取于南方医院妇产科足月剖宫产的健康孕妇。无菌保存3 h 内进行分离。

1.1.2 主要试剂 α-MEM 培养基、胎牛血清（FBS）、EDTA-胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）（Gibco），青霉素-链霉素双抗、非必需氨基酸、L-谷氨酸（Sigma），人重组IFN-γ因子（Peprotech），流式荧光抗体（Gibco），CCK-8 试剂盒（Dojindo），SSEA-4 免疫荧光抗体（abcam），Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（MultiSciences），PGE-2 试剂盒（elabscience）、sHLA-G 试剂盒（Exbio）。

1.1.3 主要仪器 流式细胞分析仪（BD LSRFortessa X-20），microplate reader（BioTekCytation5），FlowJo V10 software（FlowJo LLC），显微镜（Olympus CKX53）。

1.2 分离和培养hAMSCs 钝性剥离新鲜胎盘的部分羊膜，剪成大小约6 cm × 6 cm 组织块，0.25%胰蛋白酶-EDTA 37 ℃水浴消化2 次，分别为10、15 min，PBS 漂洗尽量去除羊膜上皮细胞，剪碎消化后的组织块至大小约1 mm×1 mm，平铺至培养瓶中静置1 h 贴壁，加入适量α-MEM 完全培养基培养，随后每3 天换液，待贴壁细胞生长密度为70%～80%时传代，记为P1，传代后贴壁细胞生长融合80%～90%时再传代，记为P2，以此类推。倒置显微镜下观察细胞生长形态。第3～6 代hAMSCs 用于本实验。

1.3 hAMSCs免疫表型鉴定 取第4代hAMSCs制成1×105/mL 单细胞悬液，在每管100 μL 的单细胞悬液中加入鼠抗人单克隆抗体CD90APC、CD73PE、CD34APC、CD45FITC、CD105 FITC、CD11bPE、HLADRPC7 各20 μL，室温避光孵育30 min，PBS 洗涤重悬后，流式细胞仪上机检测。

1.4 hAMSCs 免疫荧光检测 取第4 代hAMSCs制作细胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.2% Tritonx-100、5% BSA 通透封闭40 min，加入抗SSEA-4一抗，4 ℃湿盒孵育过夜，羊抗鼠IgG/Cy3 二抗室温避光孵育1 h，DAPI 核染色，室温避光孵育2 min，封片，荧光显微镜下观察拍照。

1.5 hAMSCs增殖能力 按照IFN-γ冻干粉试剂说明书溶解、稀释IFN-γ，最终浓度分别为10、30、50、70、100 ng/mL。含不同浓度IFN-γ的α-MEM 完全培养基培养hAMSCs，调整细胞浓度为1×104/mL，按每孔100 μL 接种于96 孔板中，各组设3 个复孔，每天取1 组细胞，加入10 μL CCK-8 避光孵育2 h，酶标仪测450 nm 处OD值，连续检测6 d，绘制生长曲线。

1.6 细胞凋亡分析 取第5 代hAMSCs，调整细胞浓度为1 × 105/mL，含不同浓度IFN-γ的α-MEM 完全培养基培养48 h，0.25%胰蛋白酶（无EDTA）消化3～4 min，PBS 洗涤后离心，500 μL Binding Buffer 重悬细胞沉淀，各管中分别加入5 μL Annexin V-APC and 5 μL PI，混匀室温避光孵育10 min，流式细胞仪上机检测。

1.7 细胞因子分析 调整细胞浓度为5×104/mL，不同浓度IFN-γ 的α-MEM 完全培养基培养hAMSCs，培养48 h，收集各组细胞培养上清液，ELISA检测PGE-2、sHLA-G 水平，紫外分光光度法检测KYN 水平，具体操作均参考试剂说明书。

1.8 统计学方法 实验数据采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，以均数±标准差表示，多组差异比较用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hAMSCs 细胞形态及鉴定 组织块法培养的原代hAMSCs 及传代后的hAMSCs 均呈梭形、成纤维样，克隆性增殖。hAMSCs 表达CD90、CD73、CD105，不表达CD34、CD45、CD19、CD11b、HLADR（图1A）；及表达人胚胎表面抗原SSEA-4（图1B）。

图1 hAMSCs 免疫表型及免疫荧光鉴定Fig1 Identification of immunophenotype and immunofluorescence of hAMSCs

2.2 不同浓度IFN-γ 对hAMSCs 增殖的影响 随着IFN-γ 浓度的增加，hAMSCs 增殖能力未受到明显影响。无IFN-γ 组和含不同浓度IFN-γ 组中hAMSCs 的增殖从第1 天至第4 天，均快速生长，随后生长速度减慢（图2）。

图2 不同浓度IFN-γ 对hAMSCs 增殖能力的影响Fig2 Effects of different concentration of IFN-γ on the proliferation of hAMSCs

2.3 IFN-γ 对hAMSCs 凋亡的影响 IFN-γ 浓度为100 ng/mL 培养hAMSCs 组与无IFN-γ 培养hAMSCs 组比较，hAMSCs 凋亡水平没有差异（P=0.78）（图3）。

2.4 IFN-γ 对hAMSCs 细胞因子分泌水平的影响 10 ng/mL 至100 ng/mL 浓 度 培养hAMSCs 时sHLA-G 水平均明显升高（P＜0.001）（图4A）；10 ng/mL IFN-γ 组和无IFN-γ 组相比PEG-2 分泌水平无差别（P=0.068），30 ng/mL IFN-γ、50 ng/mL IFNγ 和无IFN-γ 组相比PEG-2 分泌水平升高（P＜0.05），70 ng/mL IFN-γ、100 ng/mL IFN-γ 和无IFN-γ组相比PEG-2 分泌水平升高（P＜0.01）（图4B）；10 ng/mL 至100 ng/mL 浓度培养hAMSCs 时上清中KYN 水平均明显升高（P＜0.001），提示IDO 酶活性较无IFN-γ 组明显增强（图4C）。

3 讨论

图3 100 ng/mL IFN-γ 对hAMSCs 的凋亡影响Fig3 Apoptosis of hAMSCs stimulated with 100 ng/mL IFN-γ

图4 IFN-γ 对hAMSCs 炎性因子分泌水平的影响Fig4 Effect of IFN-γ on the level of inflammatory factors secreted by hAMSCs

50年前IFN-γ 作为病毒抑制蛋白首次被Frederick Wheelock 发现，由NKs、Th1、细胞毒CD8+T 细胞、巨噬细胞等分泌的重要促炎症因子，在炎症性疾病如GVHD 的起始、发生、发展中起到重要作用［1-2］。IFN-γ在临床上用来抗病毒、抗肿瘤，目前越来越多的研究发现IFN-γ具有免疫调节作用。IFN-γ能够通过IDO 代谢途径对免疫细胞及MSC 等发挥直接或间接免疫激活、免疫抑制或诱导免疫耐受作用。MSCs 发挥免疫调节作用需要炎症环境中IFN-γ的激活。IFN-γ激活的BMMSCs 分泌及免疫调节能力增强，有效防治GVHD，且随着IFN-γ浓度增加BMMSCs 的免疫抑制作用增强［3-5］。本研究结果中，未经IFN-γ处理的hAMSCs 具有弱IDO酶活性，分泌低水平细胞因子PGE-2、sHLA-G，经IFN-γ处理的hAMSCs 分泌PGE-2、sHLA-G 水平提高，IDO 酶活性增强，随着IFN-γ浓度的增加，hAMSCs 的IDO 酶活性及分泌PGE-2、sHLA-G 分泌功能增强，表明IFN-γ的刺激能增强hAMSCs 的免疫调节能力。IFN-γ激活的MSCs 能上调MSCs 表面B7-H1 表达，通过STAT-1 信号通路影响MSCs 的免疫抑制功能，在MSCs 的免疫调节中发挥重要的协同作用［10］，但IFN-γ增强hAMSCs 免疫调节功能的机制仍需进一步研究。

hAMSCs 来源于胎盘羊膜，易于获得，数量丰富，具有MSCs 的生物学特征，低免疫源性及免疫调节作用，已经用于再生医学领域及自身免疫疾病［9，11-12］。hAMSCs 可通过分泌可溶性因子发挥固有性和适应性免疫调节作用。hAMSCs 可通过IDO酶、sHLA-G、白介素-10（interleukin-10，IL-10）、TGF-β1、PGE-2 等炎性介质调节CD4+/CD8+T 细胞，诱导免疫耐受作用，调节成熟树突状细胞（mature dendritic cells，mDCs）转变成耐受性树突状细胞（tolerated dendritic cells，tDCs），进一步通过sHLA-G 诱导产生免疫抑制性调节性T 细胞（regulatory T cells，Tregs）。本实验中结果表明，hAMSCs 具有IDO 酶活性，分泌sHLA-G、PGE-2 细胞因子的能力，但IFN-γ激活后的hAMSCs 对免疫细胞的调节作用仍待研究。研究表明，IFN-γ不影响人脐带间充质干细胞（human umbilical cordderived mesenchymal stromal cells，hUC-MSCs）的增殖能力。与既往报道一致，本研究中不同浓度IFN-γ组中hAMSCs 的增殖能力无明显变化，100 ng/mL IFN-γ组hAMSCs 无凋亡情况，结果表明IFN-γ不影响hAMSCs 的增殖，不诱导hAMSCs 凋亡。

综上所述，hAMSCs 不仅能用于再生医学领域中，越来越多的研究聚焦在其免疫调节作用，尤其关注对GVHD 的临床应用。本实验研究结果表明促炎症因子IFN-γ 在不影响hAMSCs 生长、增殖的情况下，能够提高PGE-2、sHLA-G 的分泌水平，增强IDO 酶活性，IFN-γ 在hAMSCs 微环境中可以发挥重要的免疫调节作用，为hAMSCs 防治GVHD 提供理论依据。