分散固相萃取－超高效液相色谱串联质谱法检测水产品中多兽药残留

张桂云，杨伟强，林振宇

(1.漳州职业技术学院食品工程学院，农产品深加工及安全福建省高等学校应用技术工程中心，福建漳州 363000;

2.闽南师范大学化学化工与环境学院，福建漳州 363000;3.福州大学化学学院，福建福州 350108)

0 引言

在水产品的养殖过程中，为了治疗和预防各种病害、提高产量效益，存在误用、滥用各种药物的情况，主要包括三苯甲烷类染料、四环素类、氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类、硝基呋喃类兽药等.这些残留在水产品中的药物经食用后在人体中蓄积，可能会产生致畸、致癌的严重危害［1－2］.因此，国家的相关法律法规对水产品中的兽药残留限量做了严格的规定［3］.目前在国家标准中，兽药残留的检测方法以分类检测为主［4－9］.对于同一个样品的多项兽残检测指标，需要进行多次的样品前处理和上机测试，检测周期长、效率低、成本高，远不能满足快速发展的检测需要.发展和建立准确、高效、经济的兽药多残留检测技术成为当前业界研究的焦点［10］.

超高效液相色谱串联质谱(UPLC－MS/MS)结合了超高效液相色谱的高选择性、高灵敏度响应性特点;能够实现多目标物在短时间内的快速分离和检测，是多兽药残留检测的首选方法［11－14］.然而由于各种兽药的理化性质具有差异性，传统的固相萃取柱净化方法无法实现样品一次处理、同时检测多参数的模式，严重制约了UPLC－MS/MS的优势.分散固相萃取(DSPE)技术是一种快速发展的样品前处理方法，通过在试样提取液中直接加入N－丙基乙二胺固相吸附剂(primary secondary amine sorbent，PSA)、石墨化炭黑(graphitized carbon black，GCB)、C18、中性氧化铝等固体吸附剂，去除大部分非目标化合物从而达到净化的效果，具有操作简便、成本经济的优点［15－16］.将DSPE方法与UPLC－MS/MS技术相结合，能够解决样品分类处理的问题，同时弥补净化不完全的不足，是多目标物检测的有效解决途径［17］.

本研究针对水产品中几类常需监测的兽药(包括三苯甲烷类染料、四环素类、氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类兽药)，结合质检部门的检测需求，建立一种分散固相萃取联合超高效液相色谱串联质谱法检测水产品中多种兽药残留的检测方法.具有操作简便、快速高效、结果准确、成本经济的特点，为监管部门的日常检测提供了有力的技术支撑.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290－6460超高效液相色谱－质谱联用仪(美国Agilent公司);T10均质机(德国IKA公司);EOFO－945066数显型多管式旋涡振荡器(美国Talboys公司);TG16－WS高速冷冻离心机(中国湘仪公司);DN－24A氮吹仪(上海比朗仪器公司).

孔雀石绿、孔雀石绿－D5、隐形孔雀石绿、隐形孔雀石绿－D6、氯霉素、氯霉素－D5、土霉素、金霉素、四环素、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星、环丙沙星标准物质(纯度:94.0%～99.7%)均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、乙腈均为德国Merck公司的色谱纯试剂;PSA粉、C18粉、无水硫酸镁购自安谱公司;其它试剂均为分析纯;实验用水为英国ELGA公司超纯水系统制备的超纯水.

1.2 标准溶液的配置

根据上述各标准物质的纯度，分别准确称取适量的兽药标准品并用甲醇溶解，配制成1.0 mg·mL－1的标准储备液，于－18℃避光保存.实验前，准确移取适量的各种兽药标准储备液用甲醇稀释，使混合标准溶液中各标准品的质量浓度分别为: 孔雀石绿 5.0 μg·mL－1、隐形孔雀石绿 5.0 μg·mL－1、氯霉素 1.0 μg·mL－1、土霉素 20.0 μg·mL－1、金霉素 20.0 μg·mL－1、四环素 20.0 μg·mL－1、磺胺嘧啶 10.0 μg·mL－1、磺胺甲嘧啶 10.0 μg·mL－1、磺胺二甲嘧啶 10.0 μg·mL－1、恩诺沙星 10.0 μg·mL－1、环丙沙星 10.0 μg·mL－1.混合内标溶液的质量浓度分别为: 孔雀石绿－D5 为 1.0 μg·mL－1、隐形孔雀石绿－D6 为1.0 μg·mL－1、氯霉素－D5 为 1.0 μg·mL－1，于 4 ℃保存.最后，用空白样品提取液稀释该混合标准溶液并添加混合内标溶液，配制成不同浓度的系列基质标准曲线，现配现用.

1.3 样品前处理

取样品的可食部分，经高速组织捣碎机捣碎、匀浆，试样于冻库保存.准确称取约5.0 g匀浆后的样品于50 mL塑料离心管中，加入混合内标溶液、3.0 mL甲酸水溶液(1%(体积分数)，含EDTA 100 mmol·L－1)和10.0 mL乙腈、萃取盐包(4.0 g硫酸钠和1.0 g氯化钠)和陶瓷均质子，涡旋振荡5 min.静置10 min后，以10 000 r·min－1高速离心5 min.于15 mL塑料离心管中加入200 mg PSA粉末、50 mg C18粉末、500 mg无水硫酸镁，以2 mL超纯水涡旋10 s活化;立即加入5.0 mL乙腈提取上清液并涡旋振荡2 min，以10 000 r·min－1高速离心5 min.取上清液氮吹，用流动相定容至1.0 mL，经0.22 mm的微孔滤膜过滤，上机测试.

1.4 仪器工作条件

色谱条件:Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 mm).流动相A为乙腈，流动相B为乙酸铵水溶液(10 mmol·L－1).梯度洗脱程序(以 A 的体积分数表示):0～1.0 min 时，A 为 10%;1.0～4.0 min时，A由10%升至 15%;7.0 min时升至 90%;7.0～8.0 min时，A 为 90%;随后降至 10%.流速为 0.25 mL·min－1，进样量为 5 mL.

质谱条件:电喷雾正/负离子模式电离(ESI+/ESI－).电喷雾电压4 000 V;干燥气温度300℃，流量5 L·min－1;雾化气压力0.35 MPa;鞘气温度250℃，流量11 L·min－1;多反应监测模式(multi－reaction monitoring，MRM)检测.各种农残检测的质谱参数见表1.

表1 兽药质谱检测参数Tab.1 MS parameters of veterinary drugs residues

1.5 方法的回收率和精密度实验

采用经测试不含待测兽药的阴性样品，向其中添加3个质量浓度水平的混合标准溶液，按照本研究所述的方法进行回收率和精密度的测试实验.其中，每个加标水平做6个平行测试样，并计算回收率及相对标准偏差(RSD).

2 结果与讨论

2.1 分散固相萃取净化条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

综合分析本实验中几类兽药的理化性质，确定偏极性的乙腈为提取溶剂.乙腈不仅可避免过多脂肪的提取，同时又可沉淀蛋白，因而适用于水产品中大多数偏极性兽药的提取［16］.此外，磺胺类、喹诺酮类兽药可呈酸碱两性，在酸性条件下更容易被萃取，因此添加一定的甲酸.而四环素类兽药易与同样液中的金属离子螯合，因此需要添加一定浓度的EDTA以屏蔽该作用［18］.在样品提取的过程中，加入适量的无水硫酸钠和氯化钠可有效防止样品中水分及水溶性杂质进入提取液中，达到脱水和盐析的效果，也有助于增强提取的效果［13］.

2.1.2 PSA、C18、无水硫酸镁用量的优化

PSA能够除去提取液中的脂肪酸、碳水化合物和色素;C18则对脂肪的去除效果明显;无水硫酸镁做为脱水剂具有强大的吸水能力，同时其与水结合后放出热量也有利于目标物的提取［15］.水产品的基质中主要含有脂肪、蛋白、碳水化合物以及色素等杂质，采用PSA、C18与无水硫酸镁的组合净化剂可有效地去除大部分干扰基质的影响.但各净化剂的用量和配比仍需进一步优化和考察，其对实验结果的影响如图1所示.

2.2 仪器条件的优化

2.2.1 色谱分离条件的选择

实验以乙腈和弱酸性乙酸铵水溶液为流动相，采用Waters BEH C18色谱柱为分离柱，通过优化合适的梯度洗脱程序，基本实现本项目中多种兽药的有效分离，有利于后续的质谱测定.其总离子流图如图2所示(测试溶液为节1.2中所配制的标准混合液稀释100倍).

图1 PSA和C18的用量对各兽药残留回收率的影响Fig.1 Effect of PSA and C18 on recovery of veterinary drugs residues

图2 兽药总离子流图Fig.2 Total ion current chromatograms of veterinary drugs residues

2.2.2 质谱检测参数的优化

实验首先以单个兽药标准品为分析物，逐个确定其检测离子对，并优化裂解电压、碰撞能等质谱检测参数(见表1).其中，氯霉素为负离子电离模式且浓度水平较低，因此对其施加600 V的EMR电压以提高质谱响应.其余兽药均为正离子电离模式，同样对浓度较低的孔雀石绿和隐形孔雀石绿施加200 V的EMR电压以提高质谱响应.根据表1所优化的质谱条件及色谱条件，选择多反应监测模式(MRM)进行检测，11种药物能在8 min内分离，目标物的MRM图如图3所示.

图3 兽药的MRM图Fig.3 MRM of veterinary drugs residues

2.3 方法的线性范围及检出限

基质效应是影响液相色谱串联质谱法对目标物定量的重要因素，研究通过在阴性样品提取液中添加不同浓度的混标配制基质标准曲线，来消除基质效应的影响，准确定量待测样品.实验结果表明，几种兽药的质谱响应强度(y)与其质量浓度(x，ng·mL－1)在一定的范围内具有良好的线性关系(见表2)，相关系数均大于0.99.为避免假阳性、确保结果的准确性，选取10倍信噪比处的信号值来计算该方法的检出限.与国标方法检出限［4－8］相比，本方法的灵敏度均优于国标方法.

表2 方法的线性回归方程、相关系数和检出限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits for this method

2.4 方法的回收率和精密度

通过加标回收实验来评价方法的准确度和精密度.取鱼、虾、牡蛎等阴性样品，添加3个水平的混合标准溶液，并按照本文所述条件进行测试，其中每个加标水平平行实验6次，结果列于表3.表3的检测结果显示，该方法的回收率为81.6%～96.6%，相对标准偏差不超过9.2%.作为一种多目标物的检测方法，该方法在简化前处理的情况下具有较高的准确度和重现性，能够满足日常检测的要求.

表3 方法的回收率和精密度(n=6)Tab.3 Results of tests for recovery and precision(n=6)

续表3Continue table 3

2.5 实际样品测试

将所建立的方法应用于质检部门的监督抽查检测任务中.在农贸市场中随机抽检100份样品，包括鱼、虾、贝等类型水产品.检测结果表明，国标规定不得检出的氯霉素在贝壳类水产品中的检出率较高，23份贝壳类样品中检出11份，检测结果在0.5～2.0 μg·kg－1.此外，一些鱼类中也检出土霉素、金霉素等四环素类残留，检测结果在 12.0～43.0 μg·kg－1，但均小于国标规定的检出限(50.0 μg·kg－1)［6］.其他项目均未见检出.

3 结语

本研究联合分散固相萃取技术和超高效液相色谱串联质谱法，发展了一种水产品中多种兽药残留的检测方法.通过优化分散固相萃取的实验条件，建立了水产品中多种类兽药残留的一次性样品前处理方法.同时采用超高效液相色谱串联质谱法为检测手段，在较短的时间内实现了多兽残目标物的高灵敏度、高通量检测.通过方法学考察和加标回收实验，表明经本方法测试的各项兽残检出限均低于现有国家标准，同时具有良好的回收率和精密度.将其应用于日常检测中，具有操作简便、快速高效、结果准确、成本经济的特点，为水产品中的多兽残检测提供了有效的解决途径.