陕北小粒黑豆皮原花青素提取工艺及抗氧化性研究

高晶晶 慕 苗 闫君芝 刘丽娜

(榆林学院化学与化工学院，陕西 榆林 719000)

原花青素是由不同数量的儿茶素和表儿茶素结合而成的聚合体[1]，具有较强的抗氧化及清除自由基能力[2]，在预防和治疗心血管疾病、抗衰老、抗过敏、抗癌、抑菌等方面有显著作用[3-6]。小粒黑豆是中国陕北地区种植的一种高产量黑豆品种，在黑豆产品加工过程中，豆皮大部分被去掉，豆皮的营养价值及其有效成分未被充分利用[7-8]。研究[9-11]表明，豆皮含有大量营养保健物质，尤其是黑紫色种皮含有大量的抗氧化性物质原花青素。目前，对黑豆皮的研究[12]主要集中在膳食纤维、色素、黄酮等方面，对黑豆皮原花青素的研究[13]鲜见报道，尤其是对其抗氧化性研究[14]则更少。

目前原花青素常用的提取方法有乙醇溶液提取法、超临界提取法及双水相萃取法等[15-16]。本研究拟采用乙醇溶液提取法，在单因素试验基础上，采用响应面法进行优化，得到黑豆皮原花青素的最佳提取工艺，并对其抗氧化性进行研究，以期为原花青素的应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1 原料和试剂

陕北小粒黑豆皮：陕西神木产；

无水乙醇：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；

甲醇、H2O2：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；

浓盐酸：分析纯，南京化学试剂股份有限公司；

邻苯三酚、FeSO4、水杨酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

香草醛、VC(抗坏血酸)、DPPH：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

电子天平：FA-1004型，上海精科天平厂；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒科学仪器有限公司；

数显超级恒温水浴：HH-501型，郑州科丰仪器设备有限公司；

分光光度计：UV-2450型，日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 儿茶素标准曲线绘制 采用儿茶素作为标准品进行检测，准确配制浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL儿茶素标准溶液，空白液为蒸馏水，取空白和各浓度的标准液1 mL于6支试管中，分别加入5 mL 2%香草醛—甲醇溶液，最后各加入1 mL浓盐酸震荡摇匀，于500 nm测其吸光度值[17-18]，以儿茶素标准液的浓度及吸光度值为横纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程y=1.089x+0.013 4，R2=0.998 4。

图1 儿茶素标准曲线

1.2.2 黑豆皮原花青素含量的检测 采用香草醛—盐酸法。准确吸取原花青素提取液1 mL，稀释一定倍数，后续操作与标准曲线制备相同。黑豆皮原花青素提取得率按式(1)计算。

(1)

式中：

R——黑豆皮花青素提取得率，%；

c——提取液中原花青素浓度，mg/mL；

v——原花青素提取液体积，mL；

m——黑豆皮质量，g。

1.2.3 单因素试验

(1) 提取液浓度对提取得率影响：准确称取10 g黑豆皮粉末于三口烧瓶中，加入150 mL浓度分别为50%，55%，60%，65%，70%的乙醇溶液，45 ℃下水浴恒温加热，冷凝回流，搅拌，提取3.5 h，过滤，500 r/min离心10 min，测定上清液吸光度值，计算原花青素的提取得率。

(2) 提取时间对提取得率影响：准确称取10 g黑豆皮粉末于三口烧瓶中，加入150 mL 60%乙醇溶液，45 ℃下水浴恒温加热，冷凝回流，搅拌，分别提取3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 h，后续方法同1.2.3(1)。

(3) 提取温度对提取得率影响：准确称取10 g黑豆皮粉末于三口烧瓶中，加入150 mL 60%乙醇溶液，分别于40，45，50，55，60 ℃下水浴恒温加热，冷凝回流，搅拌，提取4 h，后续方法同1.2.3(1)。

(4) 液料比对提取得率影响：准确称取10 g黑豆皮粉末于三口烧瓶中，分别加入100，150，200，250，300 mL 60%乙醇溶液，50 ℃下水浴恒温加热，冷凝回流，搅拌，提取4 h，后续方法同1.2.3(1)。

1.2.4 响应面试验 在单因素试验的基础上，以提取时间、提取温度、液料比为试验因素，以提取得率为评价指标，设计三因素三水平响应面试验优化原花青素提取工艺条件[19]。

1.2.5 黑豆皮中原花青素的抗氧化性测定

(1) DPPH自由基清除率：准确称取一定量的DPPH溶解于无水乙醇配制成浓度为0.2 mmol/L的溶液，放置于棕色瓶中保存，现配现用。取黑豆皮原花青素配制成浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL的溶液，取各浓度待测液2 mL分别加入2 mL DPPH乙醇溶液，摇匀，室温避光下静置30 min，517 nm下测定其吸光度值[20]。同时还需空白对照及同条件下Vc的DPPH自由基清除率的测定。DPPH自由基清除率按式(2)计算。

(2)

式中：

X——DPPH自由基清除率，%；

A0——原花青素液和DPPH混合液的吸光度值；

A1——原花青素液和空白溶剂(无水乙醇)混合液的吸光度值；

A2——DPPH溶液和空白溶剂混合液的吸光度值。

(2) 羟基自由基清除率：取5支试管分别加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4溶液和2 mL水杨酸溶液，摇匀后，分别加入2 mL浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的黑豆皮原花青素溶液，最后加入2 mL 0.3% H2O2溶液， 37 ℃下反应30 min，510 nm下测定吸光度值[21]。同时还需做空白对照及同条件下VC的羟基自由基清除率的测定。羟基自由基清除率按式(3)计算。

(3)

式中：

Y——羟基自由基清除率，%；

A0——空白液的吸光度值；

A1——原花青素液的吸光度值。

(3) 超氧阴离子清除率：取1 mL浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0. 5 mg/mL的黑豆皮原花青素溶液，依次加入pH 8.2，0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液3 mL， 30 ℃水浴20 min，加入7 mmol/L邻苯三酚3 mL混匀，反应4 min，加入1 mL浓盐酸终止反应， 320 nm下测定吸光度值[22]。同时还需做空白对照及同条件下Vc的超氧阴离子清除率的测定。超氧阴离子清除率按式(4)计算。

(4)

式中：

Z——超氧阴离子清除率，%；

A0——原花青素液的吸光度值；

A1——以H2O代替邻苯三酚的吸光度值；

A2——以H2O代替原花青素液的吸光度值。

1.3 数据处理

用Excel 2003对试验所得数据进行统计计算，单因素试验采用Origin 8.0作图，响应面优化采用Design expert 10。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图2(a)可知，在乙醇浓度为60%时，原花青素的提取效果较好，其他浓度不利于原花青素的溶出。由图2(b)得出提取时间为4 h时提取得率最高，可能是由于超过4 h后，一部分原花青素分解，提取得率反而下降。由图2(c)可知，提取温度为50 ℃时提取得率最高，可能是其他温度不利于原花青素的溶出，高温可能导致一部分原花青素分解。由图2(d)得出原花青素的提取得率随液料比的增大而升高，当液料比超过20∶1(mL/g)时，增大溶剂用量并不能提高原花青素的提取得率。因此，选择液料比为20∶1(mL/g)。综上所述，在乙醇浓度60%、提取时间4 h、提取温度50 ℃、液料比20∶1(mL/g)时，陕北小粒黑豆皮中原花青素的提取得率较高，可达5.25%。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 试验设计与结果分析 根据单因素试验结果，以原花青素提取得率为响应值，根据Box-Benhnken中心组合原理进行响应面设计，试验因素水平见表1，试验设计与结果见表2。

2.2.2 模型的建立及方差分析 由表3可知，回归模型P<0.000 1，达到高度显著水平，失拟误差项P>0.05，不显著，说明该模型误差小，拟合度好；可预测黑豆皮原花青素的提取过程及提取结果。 BC、AC项的P值<0.000 1，说明温度和液料比、时间和液料比的交互作用对提取得率的影响最大，为主要限制因素；从一次项的P值可知，液料比对提取得率的影响最大，其次是提取温度和提取时间。通过响应面软件的分析和计算，得回归方程：

图2 提取条件对黑豆皮中原花青素提取得率的影响

表1 响应面因素与水平设计表

Y=5.32+0.099A+0.14B-0.15C-0.097AB-0.32AC-0.033BC-0.51A2-0.85B2-0.73C2。

(5)

2.2.3 响应面分析 由图3可知，提取温度大于提取时间的影响，液料比明显大于提取时间的影响，液料比大于提取温度的影响，与2.2.2中P值比较得出液料比>提取温度>提取时间一致。

由响应面法建立的提取模型及回归方程预测的最优提取工艺条件为提取时间4.16 h、提取温度52.77 ℃、液料比22∶1(mL/g)，预测提取得率5.463%。为便于操作，将提取条件修正为提取时间4.2 h、提取温度53 ℃、液料比22∶1(mL/g)，进行3次试验验证，得到黑豆皮原花青素平均提取得率为5.380%，与预测值5.463%基本接近，说明该提取模型预测优化黑豆皮原花青素提取工艺是准确可行的。

表2 响应面试验方案与提取得率

2.3 原花青素抗氧化性试验

2.3.1 DPPH自由基清除率 从图4可以看出，随着原花青素和VC浓度的增加，DPPH自由基清除率逐渐增加。同浓度下，VC对DPPH自由基清除率均略高于原花青素。浓度均为0.10 mg/mL时，原花青素的清除率为68.5%，而VC的清除率可达73.8%。黑豆皮原花青素的IC50值为0.075 mg/mL。结果表明：黑豆皮原花青素对DPPH自由基清除率与VC基本接近，且在一定的范围内其浓度与DPPH自由基清除率存在一定的量效关系。

表3 提取模型的显著性检验及分析表†

† P<0.000 1差异高度显著；P<0.05差异显著；P>0.05差异不显著。

图3 两因子交互作用对提取率的响应面图

图4 原花青素对DPPH自由基的清除作用

2.3.2 羟基自由基清除率 从图5可以看出，随着原花青素和VC浓度的增加，羟基自由基清除率逐渐增加，但增加速率逐渐变缓。同浓度下，VC对羟基自由基清除率略高于原花青素。浓度为1.0 mg/mL时，原花青素的清除率为68.7%，VC的清除率为74.3%。黑豆皮原花青素的IC50值为0.590 mg/mL。结果表明：黑豆皮原花青素对羟基自由基清除率与VC基本接近，有较好的羟基自由基清除能力。

图5 原花青素对羟基自由基的清除作用

2.3.3 超氧阴离子清除率 从图6可以看出，随着原花青素和VC浓度的增加，超氧阴离子清除率增加。VC的清除率大于原花青素的。浓度为0.5 mg/mL时，原花青素清除率为77.6%，VC清除率为82.5%。黑豆皮原花青素的IC50值为0.220 mg/mL。

图6 原花青素对超氧阴离子的清除作用

3 结论

本试验对陕北小粒黑豆皮原花青素提取进行了研究，在单因素试验基础上采用响应面法优化，得到最佳提取工艺条件为提取时间4.2 h、提取温度53 ℃、料液比22∶1(mL/g)、乙醇浓度60%，在此条件下陕北小粒黑豆皮原花青素平均提取得率为5.380%。黑豆皮原花青素的抗氧化性试验研究表明原花青素对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子均具有一定的清除效果，该抗氧化能力与原花青素浓度有一定的关系，其IC50值分别为0.075，0.590，0.220 mg/mL。通过本试验说明陕北小粒黑豆皮原花青素含量可观且具有较好的抗氧化活性，后续可对黑豆皮中原花青素的抗氧化有效成分作进一步研究。