不同类型江西名茶儿茶素含量及体外抗氧化能力比较

王学渊 刘静宜 洪艳平 李雨薇 柯法钧 陈薪竹 杨武英

(1. 江西农业大学食品科学与工程学院，江西 南昌 330045；2. 江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌 330045；3. 华南农业大学食品学院，广东 广州 510642)

中国江西气候温和、雨水充沛，拥有适宜的茶叶生长自然条件，产出的茶叶品质优良，其中庐山云雾、遂川狗牯脑、井冈翠绿、上饶白眉、修水宁红、靖安白茶等均为江西名茶的代表[1]。研究表明茶叶具有良好的抗氧化能力[2-3]，能有效清除自由基并抑制机体自由基损伤[4-5]，具有抗癌[6]、抗辐射[7-8]、防治疾病[9]和延缓衰老[10]等功能。茶多酚是茶叶中的主要抗氧化物质，其含量达茶叶干重的18%～36%[11]。茶多酚主要包括儿茶素[12]、茶黄素[13]、没食子酸[14-15]和黄酮等[16]，而其中儿茶素占比最大。目前尚未见对江西众多茶叶中的儿茶素及其抗氧化能力进行分析的研究。本研究拟选取江西11种名茶作为研究对象，采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分别对其总儿茶素、儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和儿茶素没食子酸酯(ECG)进行测定和比较，并采用DPPH自由基清除能力、铁还原抗氧化能力、ABTS+自由基清除能力、总还原能力4项指标对样品的体外抗氧化能力进行测定和比较，旨在了解各种江西名茶中的儿茶素含量差异以及体外抗氧化能力差异，为消费者选择适合的茶叶以及江西茶叶的种植和加工提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿茶、红茶、白茶3种类型共11种江西名茶茶叶样品：江西省南昌市鹿鼎国际茶叶城；

1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)：纯度≥97%，东京化成工业株式会社；

乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA、抗环血酸、乙酸：色谱纯，西陇化工股份有限公司；

2,4,6-三吡啶基-S-三嗪(TPTZ)：纯度99%，金克隆生物技术有限公司；

2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：纯度98%，金克隆生物技术有限公司；

水溶性维生素E标准品(Trolox)、儿茶素标准品(C)、表儿茶素标准品(EC)、表没食子儿茶素标准品(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯标准品(EGCG)、儿茶素没食子酸酯标准品(ECG)：纯度≥98%，金克隆生物技术有限公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，美国天地有限公司；

超纯水：实验室MILLIPORE超纯水机制备。

1.2 仪器与设备

高速多功能粉碎机：XY-200型，星宇仪器有限公司；

高速冷冻离心机：HC-2518R型，杭州华创科学器材有限公司；

可见分光光度计：723N型，上海光学仪器一厂；

高效液相色谱仪：Waters e2695型，美国Waters公司；

循环水真空泵：SHB-III型，河南省予华仪器有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-4型，常州亿通分析仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 儿茶素含量的测定 参照GB/T 8313—2008采用高效液相色谱法对11种茶叶中的5种儿茶素含量进行测定。

(1) 色谱条件：色谱柱为Waters Spherisorb C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温35 ℃；流速0.9 mL/min；紫外检测器波长λ=278 nm；进样量10 μL；梯度洗脱程序为：100% A相(90 mL乙腈+20 mL乙酸+2 mL 10 mg/mL EDTA溶液，用超纯水定容至1 L，摇匀，过0.45 μm 膜)保持10 min→15 min内由100% A相变化至68% A、32% B相(800 mL乙腈+20 mL乙酸+10 mg/mL EDTA溶液2 mL，用超纯水定容至1 L，摇匀，过0.45 μm膜)→68% A相、32% B相保持10 min→100% A相。色谱图见图1。

图1 儿茶素标准溶液和茶叶样品溶液的色谱图

(2) 标准曲线的制备：用稳定溶液(25 mL 10 mg/mL EDTA溶液+25 mL 10 mg/mL抗坏血酸溶液+50 mL乙腈，用超纯水定容至500 mL，摇匀)将EGC、C、EC、EGCG、ECG配置为不同浓度的系列混合标准溶液，进行HPLC检测，以峰面积为纵坐标，儿茶素标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

(3) 精密度试验：分别取5个不同浓度梯度的儿茶素标准溶液，在上述色谱的工作条件下，进行HPLC检测，每个浓度6次平行，对结果进行批次内差异分析，计算精密度。

(4) 江西名茶样品中儿茶素含量的测定：准确称取11种干燥粉碎过筛的江西名茶样品各0.2 g于10 mL离心管中，加入预热到70 ℃的70%甲醇溶液5 mL，充分搅拌均匀，立刻转移到90 ℃的水浴中，提取10 min，提取结束后冷却到室温，离心10 min(3 500 r/min)，将上清液转移至10 mL容量瓶中，残渣重复提取离心1次，2次上清液合并定容至同一容量瓶中。用移液管移取2 mL提取液至10 mL容量瓶中，用稳定溶液定容，摇匀，过0.45 μm滤膜。进样10 μL，对11种江西名茶中5种儿茶素的含量进行HPLC测定。

(5) 加标回收试验：准确称取6份同种茶叶样品0.2 g 于10 mL离心管中，其中2份做对照(即不加标准品)，其他4份分为2组，每组加入不同水平的5种儿茶素标准品，每种水平2个平行样。第1组(水平1)EGC、C、EC、EGCG、ECG 5种儿茶素标准品的加入质量分别为24.99，12.50，25.38，64.64，60.89 mg；第2组(水平2)的加入质量分别为10.00，5.00，9.63，5.43，9.10 mg。样品处理步骤同1.3.1(4)。按照上述1.3.1(1)高效液相色谱工作条件，每次进样10 μL，测定加标和未加标茶叶样品中5种儿茶素的含量。按式(1)计算加标回收率。

(1)

式中：

A——加标回收率，%；

A0——未加标样测定值，mg/g；

A1——加标样测定值，mg/g；

B——加标量，mg/g。

1.3.2 体外抗氧化能力的测定

(1) 茶叶提取液的制备：准确称取各种茶叶各0.400 0 g，置于小烧杯中，加入100 ℃蒸馏水50 mL，浸泡15 min，过滤；滤渣再用相同方法浸泡过滤，2次滤液合并于100 mL容量瓶，用蒸馏水定容，得到茶叶提取液，待进一步稀释。注意避光保存。

(2) 清除DPPH自由基能力：根据文献[17]在3只试管中分别加入2 mL DPPH液+2 mL 蒸馏水(S0)、2 mL DPPH液+2 mL不同浓度的Trolox标准溶液(S1)、2 mL无水乙醇+2 mL不同浓度 的Trolox标准溶液(S2)，混匀，室温下置于暗处反应30 min，在517 nm处测定3组溶液的吸光度(A0、A1、A2)。平行测定3次，结果取其平均值。以DPPH自由基清除率为纵坐标，Trolox浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。将1.3.2(1)中的茶叶提取液稀释100倍，代替标准品按上述相同步骤进行吸光度测定并按式(2)计算清除率。

(2)

式中：

DPPH——自由基清除率，%；

A0——空白对照吸光度；

A1——样品溶液的吸光度；

A2——抗氧化剂本底吸光度。

(3) 铁还原抗氧化能力：根据文献[18—19]取0.1 mL 不同浓度的FeSO4工作液于试管，加入1.0 mL新鲜配制的 FRAP试剂(由 0.3 mol/L 醋酸盐缓冲液，10 mmol/L TPTZ 溶液，20 mmol/L FeCl3溶液按体积比 10∶1∶1 组成)，混匀后在37 ℃水浴下反应40 min，待冷却到室温后，测定波长 593 nm 处的吸光度。平行测定3次，结果取其平均值。以摩尔浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制硫酸亚铁抗氧化能力标准曲线。将1.3.2(1)中的茶叶提取液稀释100倍，代替标准品按上述相同步骤进行铁还原抗氧化能力的测定。

(4) 清除ABTS+自由基能力：根据文献[20—21]取0.1 mL不同浓度的Trolox标准溶液于试管，加入3.9 mL ABTS+反应试剂，震摇10 s以充分混匀，室温静置6 min，立刻测734 nm处的吸光值。再以0.1 mL蒸馏水+3.9 mL ABTS+反应试剂作为空白对照组，在734 nm波长处测定吸光度A0。平行测定3次，结果取其平均值。以 ABTS+自由基清除率为纵坐标，以 Trolox 浓度为横坐标绘制标准曲线并计算回归方程。将1.3.2(1)中的茶叶提取液稀释10倍，代替标准品按上述相同步骤测定吸光度A1并按式(3)计算其清除率。

(3)

式中：

ABTS+——自由基清除率，%；

A0——空白对照组吸光度；

A1——样品溶液吸光度。

(5) 铁氰化钾还原能力：根据文献[21]取2 mL稀释10倍的茶叶提取液于试管，加入磷酸缓冲液(pH=6.6)和1%铁氰化钾溶液各2 mL，混匀，置于50 ℃水浴中20 min，迅速冷却后，加入10%三氯乙酸溶液2 mL。混合后，利用高速冷冻离心机以3 000 r/min离心10 min，取2 mL上清液，再加入蒸馏水2 mL和0.1% FeCl3溶液0.5 mL，静置10 min，用蒸馏水为空白，测定波长700 nm处的吸光度。平行测定3次，结果取其平均值。

1.3.3 11种江西名茶儿茶素含量及体外抗氧化能力比较分析 采用Microsoft Excel 2003软件进行试验数据处理，采用SPSS Statistics 19.0软件对不同类型江西名茶儿茶素含量及体外抗氧化能力进行差异显著性比较分析，以P<0.05为显著性差异水平，以P<0.01为极显著性差异水平。

2 结果与分析

2.1 11种江西名茶儿茶素含量比较分析

2.1.1 标准曲线的制备 各种儿茶素的标准曲线回归方程和相关系数如表1所示，由标准曲线的相关系数R2值可知5种儿茶素的标准曲线线性关系都良好，符合要求。

2.1.2 精密度试验结果 由表2可知，5种儿茶素精密度试验的RSD在0.11%～2.70%，均符合要求。

2.1.3 加标回收试验 由表3可知，5种儿茶素的2个不同添加水平的加标回收率在 66.24%～123.20%，说明建立的方法符合要求。

2.1.4 11种江西名茶中儿茶素含量的测定和比较分析

采用本试验建立的高效液相色谱法对11种江西名茶中儿茶素的含量进行测定，测定结果见表4。由表4可知，11种茶叶中EGC含量婺源毛尖、庐山云雾、井岗翠绿、靖安白茶和资溪白茶与其他6种茶叶相比差异极显著(P<0.01)，婺源毛尖、庐山云雾和资溪白茶之间差异不显著，井岗翠绿和靖安白茶跟婺源毛尖、庐山云雾、资溪白茶之间差异极显著(P<0.01)，修水宁红、武夷红茶、祁红茶、浮红茶、遂川狗牯脑、浮瑶仙芝之间差异不显著；C含量靖安白茶与其他10种茶叶比较差异极显著(P<0.01)，其他10种茶叶中，井岗翠绿相较修水宁红、武夷红茶、祁红茶、浮红茶、遂川狗牯脑差异显著(P<0.05)，有的差异不显著；EC含量靖安白茶和祁红茶与其他9种茶叶差异极显著(P<0.01)，其他9种茶叶中，浮红茶相较修水宁红、浮瑶仙芝、婺源毛尖、庐山云雾和井岗翠绿差异显著(P<0.05)，有的差异不显著；EGCG含量靖安白茶和庐山云雾与其他9种茶叶相比差异极显著(P<0.01)，其他9种茶叶相比有的差异显著(P<0.05)有的差异不显著；ECG含量靖安白茶、井岗翠绿和婺源毛尖与其他8种茶叶相比差异极显著(P<0.01)，靖安白茶跟井岗翠绿和婺源毛尖相比差异极显著(P<0.01)，井岗翠绿和婺源毛尖差异不显著，其他8种茶叶中，庐山云雾与4种红茶相比差异显著(P<0.05)有的差异不显著；总儿茶素含量靖安白茶与其他10种茶叶差异显著(P<0.05)，除靖安白茶外其他10种茶叶儿茶素含量差异不显著，可见不同茶叶中各种儿茶素的含量差异不大，绿茶和白茶总儿茶素和各种儿茶素含量总体比红茶高。

表1 5种儿茶素含量的标准曲线方程及相关系数

表2 精密度试验结果

表3 加标回收试验结果

表4 11种种江西名茶中儿茶素含量检测结果†

† 同列大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2 11种江西名茶体外抗氧化能力比较分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力 将不同种类的茶叶提取液与DPPH溶液反应30 min后，反应体系颜色变浅，说明茶叶提取液具有清除自由基的能力[22]。茶叶样品的DPPH自由基清除能力TEAC值(Trolox equivalent antioxidant capacity)以达到同样清除率所需Trolox的浓度(mg/L)来表示，TEAC值越大，则对DPPH自由基清除能力越强。如图2所示，各种茶叶样品的TEAC值依次为修水宁红<浮红茶<祁红茶<武夷红茶<狗牯脑<庐山云雾<靖安白茶<资溪白茶<婺源毛尖<浮瑶仙芝<井岗翠绿；3种类型的茶叶DPPH自由基清除能力总体呈现出红茶<白茶和绿茶的趋势。不同类型茶叶的DPPH自由基清除能力有显著差异(P<0.01或P<0.05)；同种类型茶叶中，修水宁红与其他红茶相较DPPH自由基清除能力有显著性差异(P<0.01)，2种白茶之间的DPPH自由基清除能力差异显著(P<0.01)，4种绿茶中婺源毛尖和浮瑶仙芝与其他3种茶的DPPH自由基清除能力也有显著差异性(P<0.01)，而有的差异不显著。

大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)

图2 不同茶叶清除DPPH自由基能力的比较

Figure 2 Comparison of scavenging DPPH free radical ability of different tea leaves (n=3)

2.2.2 FRAP铁还原抗氧化能力 将不同种类的茶叶提取液与FRAP试剂反应后，反应体系变蓝紫色，说明茶叶具有还原Fe3+的能力。茶叶样品的FRAP值以达到同样吸光度所需FeSO4的浓度(mol/L)来表示，FRAP值越大，则铁还原抗氧化能力越强。如图4所示，各种茶叶样品的FRAP值依次为修水宁红<武夷红茶<浮红茶<祁红茶<狗牯脑<资溪白茶<庐山云雾<浮瑶仙芝<婺源毛尖<靖安白茶<井岗翠绿；3种类型的茶叶铁还原氧化能力总体呈现出红茶<白茶和绿茶的趋势。3种类型的茶叶铁还原氧化能力总体呈现出红茶<白茶和绿茶的趋势；不同类型茶叶的铁还原氧化能力有显著性差异(P<0.01)；同种类型茶叶中，4种红茶间的铁还原氧化能力有显著性差异(P<0.01)，2种白茶间差异显著(P<0.01)，5种绿茶中狗牯脑和井岗翠绿与其他3种绿茶的铁还原氧化能力差异也具显著性，有的差异不显著。

大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)

图3 不同茶叶FRAP值的比较

Figure 3 Comparison of FRAP values of different teas (n=3)

2.2.3 ABTS+自由基清除能力 不同种类的茶叶提取液与ABTS+溶液反应后，反应体系颜色变浅，说明茶叶提取液具有清除ABTS+自由基的能力。茶叶样品的抗氧化能力TEAC值以达到同样清除率所需Trolox的浓度(mg/L)来表示，TEAC值越大，则对ABTS+自由基清除能力越强。如图6所示，各种类型茶叶的ABTS+自由基清除能力依次为浮红茶<修水宁红<祁红茶<武夷红茶<狗牯脑<庐山云雾<资溪白茶<浮瑶仙芝<靖安白茶<婺源毛尖<井岗翠绿；3种类型茶叶的ABTS+自由基清除能力总体呈红茶<白茶和绿茶的趋势。4种红茶和2种白茶、5种绿茶相比差异均显著(P<0.01)，绿茶和白茶相比，其中狗牯脑、庐山云雾、婺源毛尖和井岗翠绿4种绿茶有显著性差异(P<0.01)，有的差异不显著；同种类型茶叶的铁还原氧化能力均有显著性差异(P<0.01)。

2.2.4 总还原能力 总还原能力既是评价物质抗氧化能力的重要指标，又是解释物质抗氧化活性的一种机理[23]。不同种类的茶叶提取液反应10 min后，反应体系颜色变深，说明茶叶提取液有还原能力，吸光度越大，则总还原能力越强。如图7所示，各种类型茶叶的总还原能力依次为修水宁红<祁红茶<武夷红茶<浮红茶<狗牯脑<资溪白茶<庐山云雾<婺源毛尖<浮瑶仙芝<靖安白茶<井岗翠绿；3种类型茶叶的总还原能力总体呈现出红茶<白茶和绿茶的趋势。4种红茶和5种绿茶、白茶的总还原能力相比差异显著(P<0.01)，绿茶和白茶相比大部分有显著性差异(P<0.01)，仅狗牯脑和资溪白茶差异不显著；同种类型茶叶的总还原能力均有显著性差异(P<0.01)。

3 结论

(1) 本试验建立的5种儿茶素高效液相色谱测定法标准曲线的相关系数R2都>0.99，精密度试验的RSD在0.11%～2.49%，加标回收率在66.24%～123.20%，均符合要求，对儿茶素测定结果比较分析后发现11种江西名茶中总儿茶素含量大部分差异不显著，只有靖安白茶跟其他10种茶叶差异极显著，各种儿茶素含量有较大差异，并且绿茶和白茶总儿茶素及各种儿茶素含量总体比红茶高。

大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)

图4 不同茶叶清除ABTS+自由基能力的比较

Figure 4 Comparison of scavenging ABTS free radical ability of different tea leaves (n=3)

大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)

图5 不同茶叶总还原能力的比较

Figure 5 Comparison of total reduction ability of different tea leaves (n=3)

(2) 本试验测定了11种江西名茶的DPPH自由基清除能力、铁还原抗氧化能力、ABTS+自由基清除能力和总还原能力4个体外抗氧化指标并对其进行了比较，结果表明3种类型茶叶的体外抗氧化能力的总体趋势与儿茶素含量的测定结果相近，仍为绿茶和白茶>红茶。可能与各类型茶叶的加工工艺不同有关。

(3) 绿茶加工过程中的杀青步骤，会使多酚氧化酶和过氧化酶等酶失活，防止儿茶素等茶多酚的进一步破坏，使得绿茶的茶多酚含量基本不变[24]；白茶的加工工艺也比较简单，只是微发酵，其茶多酚含量也没有很大变化；而红茶的茶多酚在加工过程中发生氧化导致其含量有所下降。故从消费者喝茶抗氧化、防衰老的角度来说，应优先选择井岗翠绿、浮瑶仙芝等绿茶，以及资溪白茶、靖安白茶。