处理方式对西藏光核桃功能因子及其抗氧化活性的影响

左力旭 刘常金 毕金峰 吕 健 金 鑫 周 沫

(1. 天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2. 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；3. 农业农村部农产品加工重点实验室，北京 100193)

光核桃[1](PrunusmiraKoehne)作为西藏地区的特色野生林果，每年产量在5 000 t以上[2]，大部分果实成熟后自然脱落，仅少部分用于鲜食，资源浪费严重。

超声、压差闪蒸和蒸汽热烫作为果蔬加工的常用技术，可钝化物料内源酶活性，抑制酶促反应[3-4]，破坏细胞结构，改变物料组织状态[5-6]，有效提高产品加工效率及食用品质。研究发现，蒸汽热烫处理能够有效剥离猕猴桃[7]、番茄果皮[8]。丰水梨经热风预干燥，利用压差闪蒸技术制得的脆片，多酚保留量最高，食用品质最佳[9]。超声处理能够有效去除番茄皮[10]，加快荷兰芹干燥速率，提高叶绿素、叶黄素等物质的保留率[11]。桃果实味道香甜，营养丰富，富含多酚、黄酮、果胶等功能因子[12]，但在加工过程中功能因子极易被破坏，降低了桃产品的食用价值。目前，关于光核桃中多酚、黄酮、果胶等功能因子的含量以及超声、压差闪蒸和蒸汽热烫处理对光核桃功能因子的影响均尚未见报道。

多酚、黄酮、多糖、果胶等功能因子，具有清除人体自由基，减缓细胞氧化，抗炎、抗癌等功效[13-14]。为进一步提升光核桃的价值空间，开发高附加值产品，提高其资源利用率，本研究拟采用超声、压差闪蒸、蒸汽热烫3种处理方式对光核桃多酚、黄酮、多糖、果胶等功能因子含量及其抗氧化活性的影响，探究功能因子含量与抗氧活性之间的关系，旨在为光核桃的有效利用和新产品开发提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

光核桃：于2018年9月3日采自西藏林芝地区，冷链空运至北京，4 ℃冷库贮藏备用；

无水碳酸钠、氢氧化钠、亚硝酸钠、九水合硝酸铝、无水乙醇、浓硫酸、甲醇、盐酸、过硫酸钾、三氯化铁：分析纯，国药集团化试剂有限公司；

没食子酸、芦丁、半乳糖醛酸等标品、福林酚试剂、水溶性维生素E(Trolox)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：分析纯，美国Sigma公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：CPA-125型，德国Sartortific公司；

数控超声波反应器：DT400型，北京弘祥隆生物技术股份有限公司；

脉动压差闪蒸干燥设备：QDPH10-1型，天津市勤德新材料科技有限公司；

高效液相色谱：Waters-1525型，美国Waters公司；

离心机：5804R型，德国Eppendorf公司；

水分活度仪：WA-99163型，美国Decagong公司；

紫外—可见分光光度计：UV1800型，日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 处理方式

(1) 超声处理：样品置于超声波反应器内，设定操作参数为：频率40 kHz、功率0.48 kW，时间分别为10，20，30 min。

(2) 压差闪蒸处理：样品置于脉动压差闪蒸干燥设备的物料托盘中，设定操作参数为：闪蒸温度 95 ℃，停滞时间10 min，闪蒸次数分别为 1，2，3。

(3) 蒸汽热烫处理：样品置于蒸锅内，蒸汽温度设为100 ℃，处理时间分别为1，2，3 min。

1.2.2 水分含量的测定 参考GB 5009.3—2016的直接干燥法。

1.2.3 可溶性固形物的测定 参考NY/T 2637—2014的折射仪法。

1.2.4 水分活度的测定 将物料切成薄片，铺满检测盒底部，放进水分活度测定仪进行测定。

1.2.5 功能因子含量的测定

(1) 多酚含量的测定：准确称取样品2.00 g，加入80%甲醇10 mL，超声辅助提取1 h后于4 ℃、9 000 r/min离心15 min，取上清液。重复提取2次，合并上清液，定容至100 mL 即得多酚提取液。含量测定参照Folin-Ciocalteu法[15]，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，结果表示为每克干样品中所含没食子酸当量(mg GAE/g DB)。

(2) 单酚含量的测定：参考Oliveira等[16]的方法并稍作修改。取1.2.5(1)中多酚提取液过0.45 μm有机系滤膜作为待测液。Agilent TC-C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL。洗脱程序为：A相为2%甲酸水，B相为丙酮(0 min，A∶B=95∶5；20 min，A∶B=75∶25；40 min，A∶B=60∶40；45min，A∶B=75∶25；50 min，A∶B=95∶5；55 min，A∶B=95∶5)。采用外标法计算样品中单酚含量。

(3) 黄酮含量的测定：取1.2.5(1)中多酚提取液1 mL作为待测液，参照Mokrani等[17]的方法进行测定。以芦丁为标准品绘制标准曲线，结果表示为每克干样品中所含芦丁当量(mg RE/g DB)。

(4) 多糖含量的测定：准确称取样品2.00 g，加入40 mL蒸馏水，90 ℃水浴浸提1 h，超声辅助提取1 h，抽滤，滤液加入其体积4倍的无水乙醇，4 ℃醇沉24 h后抽滤，滤渣溶解定容至100 mL，3 500 D透析袋透析72 h得多糖待测液。采用苯酚—硫酸法[18]进行测定，以葡萄为标准品绘制标准曲线，结果表示为每克干样品中所含葡萄糖当量(mg GE/g DB)。

(5) 果胶含量的测定：准确称取样品30.00 g，加入95%乙醇150 mL，醇沉14 h后过滤，滤渣用95%乙醇洗涤至无色后于40 ℃烘箱烘干，得到醇不溶性物质(AIR)。准确称取0.50 g AIR，加入90 mL蒸馏水，沸水浴5 min，冷却后过滤，滤液定容至100 mL，3 500 D透析袋透析72 h 得果胶待测液。参考 Mccready等[19]的方法进行含量测定，以半乳糖醛酸为标准品绘制标准曲线，结果表示为每克醇不溶性物质中半乳糖醛酸当量(mg GalA/g AIR)。

1.2.6 功能因子抗氧化活性的测定

(1) DPPH自由基清除能力：参考Si等[20]的方法并稍作修改。将2 mL样品或Trolox标准液与4 mL 100 μmol/L DPPH混匀，暗处静置30 min，517 nm处测吸光值，结果表示为每克干样品中所含Trolox当量(μmol Trolox/g)。

(2) ABTS自由基清除能力：参Yeoh等[21]的方法并稍作修改。将0.4 mL样品或Trolox标准液与3.6 mL 100 μmol/L ABTS混匀，734 nm处测吸光值，结果表示为μmol Trolox/g。

(3) FRAP铁离子还原能力：参考Jayasekera等[22]的方法并稍作修改。将0.2 mL样品或Trolox标准液与6 mL FRAP混匀，37 ℃条件下保温30 min，593 nm处测吸光值，结果表示为μmol Trolox/g。

1.2.7 统计方法 采用Excel、SPSS 20对数据进行处理，Origin 8.5进行作图。每组试验重复3次，试验结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 处理方式对光核桃水分含量、可溶性固形物、水分活度的影响

由表1可知，超声处理破坏了光核桃的细胞结构，部分内容物流失[23]，可溶性固形物减少；自由水增加，水分含量和水分活度升高。压差闪蒸处理使光核桃内部水分瞬间蒸发，水分含量和水分活度降低；细胞在压差作用下胀裂，物料孔隙度增加[24]，促进内容物溶出，可溶性固形物增加。蒸汽热烫处理在光核桃表面形成薄水层，水分含量增加，水分活度升高；部分细胞在热力作用下坍塌[5]，内容物流失，可溶性固形物略有降低。

表1 处理方式对光核桃水分含量、可溶性固形物、水分活度的影响†

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2 处理方式对光核桃功能因子含量的影响

2.2.1 多酚和单酚含量 酚类物质主要分布在植物细胞的液泡中，处理方式对液泡破坏程度不同，对酚类物质的影响也不同[25]。相比对照组，超声和压差闪蒸处理均不利于光核桃多酚的保留，蒸汽热烫处理可显著提高光核桃多酚的含量(图1)，其中，光核桃经蒸汽热烫1 min，多酚含量增加了20%。由图2可知，蒸汽热烫处理能够较好地保留光核桃的主要单酚(新绿原酸、儿茶素和绿原酸)物质。与新绿原酸相比，绿原酸和儿茶素相对稳定，保留率较高。相比较对照组，蒸汽热烫对绿原酸、儿茶素含量基本无影响，而超声处理和压差闪蒸处理降低绿原酸和儿茶素含量；而3种处理方式对新绿原酸均有破坏作用。

研究发现超声通过破坏植物细胞可高效辅助提取多酚[6]、多糖[26]、果胶[27]等功能性物质。同样，超声处理可促进光核桃中酚类物质溶出，但超声引起的局部高温(5 000 K)导致水分子分解，产生·OH，酚类物质因猝灭自由基造成检测量降低[28]。压差闪蒸通过高温和压力差推动光核桃内部水分快速蒸发，液泡和细胞膜破裂，形成多孔通道[29]，引起酚类物质与氧气发生氧化降解。蒸汽热烫过程中，光核桃表面形成隔氧薄水层，高温钝化多酚氧化酶，二者有效阻止酚类物质被氧化[30]，但过长时间的热处理会导致多酚降解。

2.2.2 黄酮含量 黄酮是2个带有酚羟基的苯环经由中心三碳链相互连接而形成的一系列化合物[31]，属于酚类物质。由图3可知，蒸汽热烫处理对光核桃中黄酮的保留率显著高于超声和压差闪蒸处理。其中，超声处理30 min，黄酮含量仅为对照组的1/3。压差闪蒸1次，黄酮含量约为对照组的70%。蒸汽热烫3 min时，黄酮含量高出对照组5 mg RE/g DB左右。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

图2 处理方式对光核桃单酚含量的影响

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2.3 多糖含量 相比较对照组，光核桃经超声处理后多糖含量显著降低，且随处理时间延长不断减少(图4)。光核桃多糖含量随压差闪蒸次数的增加呈升高趋势，压差闪蒸3次时，多糖含量比对照组高出11.84%。蒸汽热烫显著提高光核桃多糖的含量，且随处理时间的延长而增加，与张霁[32]的研究结果一致。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

多糖是结构复杂的大分子聚合物，在较强外力作用下易发生降解。研究[33-34]发现超声可打断C—O—C和C—O—H键，使多糖主链断裂，降解为寡糖甚至单糖，导致多糖含量降低。压差闪蒸产生的压力差可破坏光核桃完整的细胞结构，高湿高热水蒸气带动组织中高分子物质发生转移，形成疏松的多孔通道，促进多糖物质溶出[35]。在蒸汽热烫处理过程中，纤维素、半纤维素、果胶等细胞壁物质受热发生解聚重排，引起光核桃组织松弛坍塌，促进可溶性多糖溶出[36]。

2.2.4 果胶含量 光核桃经不同处理后的果胶含量如图5 所示，其变化趋势与多糖含量的变化趋势一致，推测果胶可能是光核桃多糖的主要成分。此外，除超声处理30 min外，其他处理组果胶含量均高于对照组，其中蒸汽热烫3 min时果胶含量高达(57.00±2.74) mg GalA/g AIR。由此可见，3种处理方式均能促进光核桃果胶的溶出。研究发现超声可通过破坏细胞壁促进果胶的溶出[37]，压差闪蒸使大分子物质发生分离重排，促使纤维素表面结合不紧密的果胶脱离，引起果胶含量增加[38]，蒸汽热烫使细胞壁果胶发生脱甲酯化和β-解聚，降低果胶与纤维素等物质的结合，促进果胶溶出[39]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3 处理方式对光核桃功能因子抗氧化活性的影响

DPPH自由基清除能力、FRAP铁离子还原能力和ABTS自由基清除能力是功能因子体外抗氧化活性最常用的评价方法。其中，DPPH自由基通过单电子氧化酚羟基和中间产物歧化反应2个过程将酚类物质氧化成醌类物质，自身还原为DPPH2[40]。FRAP铁原子还原试验是在低pH条件下，酚类、维生素C等抗氧化活性物质通过提供氢原子终止自由基链反应，将Fe3+-TPTZ还原为Fe2+[41]。不同试样与ABTS自由基反应机制不同，电子转移和氢质子转移2种途径均可清除ABTS自由基，优势途径与试样的组成、结构相关[42]。

2.3.1 多酚和黄酮的抗氧化活性 由表2可知，相比较对照组，光核桃经蒸汽热烫处理后，多酚和黄酮含量显著升高，羟基数目随之增加，多酚和黄酮DPPH自由基清除能力、FRAP铁离子还原能力和ABTS自由基清除能力均显著提高。光核桃多酚和黄酮的含量及其抗氧化活性随超声、压差闪蒸处理呈显著降低趋势。光核桃多酚和黄酮的DPPH自由基清除能力和FRAP铁原子还原能力随超声处理时间延长、闪蒸次数增加、蒸汽热烫时间延长呈增加或减少趋势，而ABTS自由基清除能力无明显趋势，这是由于ABTS自由基的清除因试样结构及组成不同达到的反应终点不同造成的[43]。

2.3.2 多糖的抗氧化活性 相比较超声处理，压差闪蒸和蒸汽热烫处理可显著提高光核桃多糖的抗氧化活性(表3)。相比较对照组，只有蒸汽热烫处理能显著提高光核桃多糖的DPPH自由基清除能力和FRAP铁原子还原能力。光核桃受热后多糖链断裂，分子量降低，构象改变，大量羟基基团暴露，抗氧化活性升高[26,44]。

2.3.3 果胶的抗氧化活性 超声、压差闪蒸和蒸汽热烫处理均可显著提高光核桃果胶的抗氧化活性(表4)，其中，压差闪蒸处理对果胶抗氧化活性的提高最为显著。由图5可知，光核桃经蒸汽热烫处理后果胶含量高于压差闪蒸处理，但其抗氧化活性显著低于压差闪蒸处理(表4)，可能是压差闪蒸处理使果胶链断裂，抗氧化基团暴露，构象发生改变，抗氧化活性加强[44]。

表2处理方式对光核桃多酚和黄酮抗氧化活性的影响†

Table2EffectofdifferenttreatmentsonantioxidantcapacityofpolyphenolandflavoneofPrunusmiraKoehne μmolTrolox/g

处理方式DPPHFRAPABTS对照组185.35±2.61c207.50±0.29d67.85±0.70a超声处理10min104.46±1.72g128.16±0.72h30.19±1.17f超声处理20min80.46±0.30h117.92±1.98i21.11±1.80g超声处理30min76.98±1.54h102.20±0.45j38.35±0.86e压差闪蒸1次147.45±2.88f161.66±1.73g45.90±0.46d压差闪蒸2次151.95±1.11e183.23±1.06f46.22±0.66d压差闪蒸3次157.36±2.41d187.44±2.64e49.92±1.02c蒸汽热烫1min203.87±1.33b261.39±0.45c68.04±2.37a蒸汽热烫2min205.46±0.75b264.29±0.63b60.37±1.21b蒸汽热烫3min210.47±2.41a273.93±0.32a66.90±1.43a

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表3处理方式对光核桃多糖抗氧化活性的影响†

Table3EffectofdifferenttreatmentsonantioxidantcapacityofpolysaccharidesofPrunusmiraKoehne μmolTrolox/g

处理方式DPPHFRAPABTS对照组3.97±0.01c6.67±0.18a6.15±0.18c超声处理10min1.31±0.18d2.13±0.09g1.53±0.13h超声处理20min1.35±0.28d1.65±0.30h1.57±0.11gh超声处理30min1.36±0.12d1.24±0.23i1.76±0.11g压差闪蒸1次4.35±0.05b4.17±0.18d6.50±0.04b压差闪蒸2次4.01±0.02c6.27±0.16b6.44±0.10b压差闪蒸3次4.09±0.09c5.84±0.11c5.56±0.08e蒸汽热烫1min5.16±0.11a6.72±0.18a6.98±0.11a蒸汽热烫2min4.20±0.14bc3.67±0.11e5.89±0.12d蒸汽热烫3min4.14±0.17bc3.33±0.07f5.16±0.02f

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.4 不同处理条件下光核桃功能因子含量与其抗氧化活性的关系

光核桃多酚含量与DPPH自由基清除能力、FRAP铁原子还原能力、ABTS自由基清除能力的线性相关系数分别为0.794，0.756，0.573[图6(a)]，黄酮分别为0.991，0.885，0.945[图6(b)]，多糖分别为0.857，0.802，0.572[图6(c)]，果胶分别为0.057，0.069，0.047[图6(d)]。综合而言，DPPH自由基清除能力与多酚、黄酮、多糖含量均呈显著线性相关，量效关系明显，因此可用DPPH自由基清除能力表征光核桃中功能性物质含量与其抗氧化活性之间的关系。

表4处理方式对光核桃果胶抗氧化活性的影响†

Table4EffectofdifferenttreatmentsonantioxidantcapacityofpectinofPrunusmiraKoehneμmolTrolox/gAIR

处理方式DPPHFRAPABTS对照组132.67±1.09e125.03±4.07g169.15±4.66e超声处理10min163.84±4.83bcd156.05±2.10f197.67±2.42cd超声处理20min165.71±4.92bc155.71±5.18de198.41±2.10cd超声处理30min170.62±2.78b171.78±3.10d203.96±2.85c压差闪蒸1次209.58±4.36a225.37±3.98ab243.41±7.58b压差闪蒸2次216.36±6.38a231.01±3.74a269.15±7.14a压差闪蒸3次217.09±8.13a220.67±5.77b246.93±9.33b蒸汽热烫1min165.86±5.16bc192.97±1.68c196.00±7.88cd蒸汽热烫2min157.78±7.12cd161.95±4.89ef193.41±0.64d蒸汽热烫3min163.26±7.33d156.74±4.27f191.37±0.64d

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

3 结论

① 超声处理和压差闪蒸处理均不利于光核桃多酚、黄酮、多糖含量及抗氧化活性的保留，但超声处理可提高果胶的抗氧化活性，压差闪蒸处理可提高多糖、果胶的抗氧化活性；② 蒸汽热烫能够显著提高光核桃多酚、黄酮、多糖、果胶的含量及其抗氧化活力；③ 光核桃经不同处理后，其多酚、黄酮、多糖含量与DPPH自由基清除能力呈正相关，量效关系显著，因此DPPH法能稳定表征功能因子含量与抗氧化活性之间的关系。综上所述，蒸汽热烫处理可作为保留光核桃功效因子的有效预处理技术，后续研究将围绕蒸汽热烫处理对光核桃系列产品品质的影响展开。

图6 光核桃功能因子含量与其抗氧化活性之间的拟合关系