湘西山莓叶挥发油化学成分及其抗氧化、抑菌活性研究

2019-07-08张敏

中国民族民间医药·下半月 2019年4期

张敏

【摘要】目的：研究湘西山莓叶挥发油化学成分，及其抗氧化活性、抑菌作用，为山莓叶挥发油的进一步开发利用提供基础依据。方法：采用水蒸气蒸馏法提取山莓叶挥发油，通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术确定其中化学成分与相对百分含量。运用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法评价山莓叶挥发油清除自由基能力，刃天青96孔板微量稀释法测试五种供试菌的抑菌作用。结果：鉴定山莓叶挥发油19种成分，占挥发油总质量的87.54%，其中酚类及含氧衍生物63.55%，烃类19.79%，酯类2.54%，醛类1.66%。山莓叶挥发油对DPPH自由基的清除呈量效关系，但效果弱于芦丁和Vc，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金杆菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌等五种供试菌均有抑菌作用，其中对痢疾志贺杆菌MIC为15.6μg/mL，效果明显好于卡拉霉素标准品。结论：山莓叶挥发油体外抗氧化能力相对较弱，对痢疾志贺杆菌抑制作用显著。

【关键词】山莓叶;挥发油;气相色谱-质谱;抗氧化活性;抑菌活性

【中图分类号】R285.5【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）8-0040-04

Abstract：ObjectThechemicalcomposition，antioxidantandantimicrobialactivitiesofthevolatileoilofRubuscorchorifoliusL.f.leaveswereinvestigated.MethodThevolatileoilwasextractedbysteamdistillation，identifiedbyGC/MSanddeterminedbypeakareanormalizationmethod.Theantioxidantactivityoftheoilwastestedby1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl（DPPH）method，theantibacterialactivitywasevaluatedbyrenzurinmicroplateassay.ResultAtotalof19componentswereidentified，themainconstituentswerephenolderivatives（63.55%），alkanes（19.79%），esters（2.54%），aldehydes（1.66%）andetc.ThevolatileoilrevealedacertainscavengingeffectonDPPHfreeradical，theclearanceeffectwasweakerthanrutinandVc.Thevolatileoilhadacertainantibacterialeffectonescherichiacoli，staphylococcusaureus，bacillusthuring-iensis，salmonella，shigelladusenterlea.Minimuminhibitoryconcentrationtoshigelladusenterleawas15.6μg/mL，thatislowerthanconcentrationofkalafunginstandard.ConclusionvolatileoilfromRubuscorchorifoliusL.f.leavesshowedweakantioxidantandcertaininhibitioneffectonshigelladusenterlea.

Keywords：RubuscorchorifoliusL.f.leaves;VolatileOil;GasChromatography-massSpectrometry;Antioxidant;Antibacterial

山莓（RubuscorchorifoliusL.f.），又名三月泡，系薔薇科Rosaceae，蔷薇亚科悬钩子属RubusL.中的一种落叶灌木[1-2]。山莓根、茎、叶、果实均可入药。根性味微苦、辛、平，具有活血化瘀、祛风除湿、解毒敛疮的功效，主治痢疾、遗精、湿疹、毒蛇咬伤、闭经痛经、风湿腰痛、小儿疳积等症[3-4]，未成熟果实性味微甘、酸、温，具有化痰解郁、醒酒止渴、涩精益肾、助阳明目之功效，常用于替代覆盆子入药做引[5-6]，主治肾虚、遗精、醉酒、丹毒等症。叶性微苦，具有解毒、消肿、敛疮、清热利咽等作用，主治咽喉肿痛、多发性脓肿、乳腺炎等症[7]。在湖南湘西山莓作为苗族药治疗腹泻，疗效确切[8]。目前湘西山莓叶及其挥发油的化学成分及抑菌活性虽见报道[9-10]，但考虑到生态环境的多样性，意味着二次代谢产物的多样性，本实验对湘西张家界山莓叶提取挥发油，GC-MS鉴定化学成分，DPPH法评价自由基清除能力[11-12]，刃天青96孔板微量稀释法测定抑菌活性[13]，试图更详细探明山莓叶挥发油其医药和保健作用的内在本质，以期更好地综合开发利用湘西山莓资源，提供重要的参考依据。

1材料

山莓叶采自吉首大学张家界校区后山，由吉首大学廖博儒教授鉴定为蔷薇科悬钩子属植物山莓R.corchorifoius的叶，阴干，粉碎后备用石油醚（沸程30～60℃）、无水硫酸钠、氯化钠、蒸馏水、DPPH自由基、无水乙醇、VC、芦丁、卡拉霉素、刃天青（Resazurin）、甲醇以上试剂均为分析纯ThermoDSQ-IIGC-MS联用仪（美国赛默飞科技公司）、紫外分光光度计、MultiskanFC酶标仪（美国赛默飞科技公司）、pH酸度计（HM-205日本TOA公司）、烘箱（DN-63日本yamato公司）、培养箱（PW/10-002重庆实验设备厂）、超净工作台（CCV-1311日本日立公司）、冰箱、高压蒸汽灭菌器（SM-52、日本）1/万天平（AEG-220日本岛津）、水蒸气蒸馏装置、电子天平、真空干燥箱、旋转蒸发仪、真空干燥器、FD-1冷冻干燥机。

2方法

2.1山莓叶挥发油的提取称取600.00g山莓叶粉于挥发油提取器中，加3000mL蒸馏水加热提取，收集蒸出液，再加入NaCl直至蒸出液饱和，然后用30～60℃的石油醚萃取，无水硫酸钠脱水，石油醚萃取液于37℃旋转蒸发仪减压浓缩，即得山莓叶挥发油。

2.2GC-MS检测条件色谱条件：石英毛细管柱BP×5（25m×0·22mm×0·25μm）;起始温度40℃，保持3min，以5.0℃/min的升温速率升到220℃，保持5min;进样温度230℃，分流比30∶

1，进样量1μL，载气为氦气，流速为1.0mL/min;质谱条件：离子源EI，离子源温度250℃，电子能量70eV，发射电流：120μA，扫描范围30～500amu。定性分析：Mainlib谱库检索，确定成分，峰面积归一化法确定相对含量。

2.3山莓叶挥发油清除DPPH自由基准确称取12.5mgDPPH·无水乙醇溶解定容，配制成50μg/mL储备液（现用现配），即为标准储备液。分别取0、2、4、6、8mL标准储备液在25mL容量瓶中定容，标准溶液浓度依次为：0、4、8、12、16μg/mL。在517nm處测定吸光度，绘制标准曲线。

称取0.2325g山莓叶挥发油于25mL容量瓶中，无水乙醇溶解定容，再分别取0、0.1、0.25、0.5、1mL于10mL容量瓶中与5mL浓度为40μg/mL的DPPH标准液混合，乙醇定容，山莓叶挥发油浓度依次为0、93、232.5、460、930μg/mL。517nm处动态测定吸光度，根据标准曲线得到DPPH·残留量。绘制不同浓度的挥发油与DPPH混合物中DPPH残留率的变化曲线。

DPPH·残留率=[DPPH·]T/[DPPH·]T0×100%式中：[DPPH·]T为某一时刻DPPH·的质浓度;[DPPH·]T0为DPPH·的起始质量浓度。

各自称取5.00mg芦丁、Vc于分别100mL容量瓶，无水乙醇定容，即得芦丁、Vc储备液。分别取0、0.5、1、1.5、2.0、2.5mL储备液于10mL容量瓶，与5mL浓度为40μg/mL的DPPH标准液混合，乙醇定容，即分别得芦丁、Vc系列溶液为0、2.5、5、7.5、10、12.5μg/mL，摇匀。在517nm处的吸光度，绘制不同浓度的Vc、芦丁与DPPH混合物中DPPH残留率的变化曲线。

2.4刃天青显色法检测山莓叶挥发油抑菌活性菌悬液的制作：各细菌株在实验室活化后继代培养，并于冰箱内4℃下保存一部分。用之前先将各细菌株在NA培养基上活化，且以MHB继代培养菌株2～3代，并在试验的前一天继代培养一次，以保证菌的生长能力达到最佳。用分光光度计测定每株细菌菌液的OD600（大肠杆菌在OD600=0.1时的菌浓约为108CFU/mL，其他细菌参照此数值）。用MHB培养基将菌液稀释到1×108CFU/mL的浓度。取5mL菌液和7.5mL的刃天青指示剂储备液混匀，用排枪吸取100μL菌液加入96孔板，除无菌对照孔外。

供测试样品和阳性对照的储液的配制：将挥发油于-10℃条件下静置24h，冷冻分层，分离上下层。用乙醇将挥发油、冷冻后挥发油的上下层及标准品配制成最大浓度为1.00mg/mL的储液，然后以倍比稀释，共配制1.00～1.95μg/mL十个浓度储备液。将上述储备液加入96孔板，每孔2μL;留无菌对照孔和生长对照孔。

刃天青指示剂配制成750μg/mL储备液，分别取取5mLMHB培养基和7.5mL的刃天青指示剂储备液混匀，用排枪吸取100μL加入96孔板的无菌对照孔。

最低抑菌浓度（MIC）的测定：将96孔板置于37℃恒温培养。每5～6小时观察一次，有细菌生长的孔逐渐由蓝色变粉，其中无菌的阴性对照孔为蓝色，细菌阳性对照空为亮红色，以发生颜色变化的前一孔为最低抑菌浓度（MIC）值。

3结果与分析

3.1山莓叶挥发油的提取水蒸气蒸馏法提取山莓叶得到挥发油0.2325g，山莓叶挥发油的得率为0.03875%。

3.2山莓叶挥发油化学成分分析山莓叶挥发油总离子流图如图1所示，其组成成分及相对含量见表1。由表1可知，确定了其中的19种成分，占总挥发油总量的98.49%，其中主要成分为4-甲基-2，5-二叔丁基苯酚（45.46%），2，3-二甲基戊烷（19.79%），2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（18.09%），2，5-十八碳二炔酸甲酯（2.54%）紫苏醛（1.66%）等。

3.3山莓叶挥发油DPPH法抗氧化活性分光光度法测定DPPH标准系列溶液在517nm处的吸光值，结果见图2，作线性回归分析，得到线性回归方程为y=0.0351x+0.0445，相关系数R2=0.9991，表明DPPH自由基浓度与其吸光度呈即显著正相关关系。

山莓叶挥发油、Vc和芦丁对DPPH自由基均有清除能力，随着样品浓度的增加，清除效果越好，而且山莓叶挥发油和Vc的清除速度比芦丁要快，如图3、图4、图5所示，当DPPH·自由基残留率为50%时，山莓叶挥发油浓度为121.9μg/mL、Vc浓度为4.8μg/mL、芦丁为6.3259μg/mL，由此可知山莓叶挥发油对DPPH自由基的清除能力明显低于Vc和芦丁，山莓叶挥发油对DPPH抗氧化活性相对较弱。

3.4山莓挥发油抑菌活性刃天青显色抑菌活性测试结果见表2，表明山莓叶挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌、苏云金杆菌均有一定的抑菌作用，而且对痢疾志贺杆菌的最低抑菌浓度（MIC）达到31.25μg/mL。挥发油冷冻下层对痢疾志贺氏杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为15.6μg/mL，低于卡拉霉素标准品。

4讨论

通过GC-MS技术对湘西张家界山莓叶挥发油的化学成分进行鉴定分析，可知其主要成分为酚类及其含氧衍生物（63.55%），烷烃类（19.79%），酯类（2.54%）醛类（1.66%）等，比较周双德测定的山莓叶挥发油的主要成分烷类（62.71%）、酯类（7.57%）、酚类（2.6%）、醇类（2.17%），程怡测定的主要成分烷类（37.4%）、醇类（16.33%）、酯类（6.52%）、酚类（2.6%）、测定成分及含量均存在差异，有待进一步研究。DPPH法结果表明湘西山莓挥发油抗氧化能力相对弱于芦丁和Vc。此外，刃天青96孔板微量稀释显色法与K-B纸片法相比较，分析方法灵敏，结果稳定，需要的試剂和样品量少，适合植物提取分离所得少量样品的抑菌活性筛选，在实验中发现山莓叶挥发油对痢疾志贺杆菌的最低抑菌浓度达到15.6μg/mL，比卡拉霉素标准品抑菌效果更好，是一种潜在的抗菌药源，有待进一步研究开发。综上所述山莓叶挥发油具有一定的抗氧化和良好的抑菌能力，作为天然抑菌剂和抗氧化剂具有良好的开发前景，同时也为湘西山莓开发利用提供理论依据。

参考文献

[1]

中国科学院中国植物志编委会.中国植物志（第37卷）[M].北京：科学出版社，1985：112.

[2]王世清，潘文刚，张志勇.苗族药三月泡的品种鉴定和成分研究[J].中国民族民间医药，2002（1）：42-44.

[3]湖南食品药品监督管理局编.湖南省中药材标准[M].2009版.长沙：湖南科技出版社，2010：286.

[4]董振生，李丹，程天印，等.山莓叶药用价值研究现状及前景分析[J].现代中药研究与实践，2008，22（1）：60-62.

[5]李蕾，孙美利，张舒媛.悬钩子属药用植物活性作用及临床应用研究进展[J].中国医药导报，2014，20（8）：92-94.

[6]陈炳化，余望.山莓资源开发及其利用[J]，资源开发与市场，2000，16（5）：286-289.

[7]傅正生，杨爱梅，梁卫东.悬钩子属植物化学成分及生物活性研究进展[J].天然产物研究与开发，2001，13（5）：86-90.

[8]周丽萍，马艳芳，刘敏，等.山莓的化学成分及抗腹泻药理学研究进展[J].广州化工，2015，46（11）：35-36.

[9]周双德，陈雪香.肖苏尧山莓叶挥发油成分分析及抑菌活性研究[J].中药材，2009，32（10）：1547-1549.

[10]程恰，程天印.山莓叶挥发油化学成分的分析[J].天然产物研究与开发，2014，26（4）：558-560.