山东苍山大蒜贮藏期新病原细菌的分离与鉴定

钟文文 孟杰 张鲁燕 于金英 许俊杰

摘要：对山东省临沂市兰陵县苍山大蒜贮藏期病害情况进行了调查，从病斑上分离得到4种真菌和1种细菌，经致病性检测发现细菌菌株LYU20170013号具有致病性。采用柯赫氏法则和病斑显微观察法对病原菌菌株LYU20170013进行了验证。通过形态学特征和16S rRNA序列分析，将LYU20170013菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。该菌在大蒜鳞茎上尚属首次报道。

关键词：解淀粉芽孢杆菌;大蒜鳞茎病害;柯赫氏法则;病原菌

中图分类号： S432.4+2;S436.33  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0205-04

大蒜（Allium sativum）是著名的兼有药效的蔬菜，属百合科葱属多年生草本植物，以鳞茎入药，具止痢、止咳、健胃、杀菌、驱虫之功效，原产中亚，南、北各省均有栽植，栽培历史悠久[1]。苍山大蒜也称作“兰陵大蒜”，亦称“葫”或“葫蒜”，产于“中国蒜乡”山东省临沂市兰陵县，苍山大蒜历史悠久，东汉崔实著《东观汉记》载：“李恂，为兖州刺史，所种小麦、葫蒜，悉付从事，无所留”。它是在兰陵县特定的生态环境条件下，经过长期的自然选择和人为定向培育而形成的兰陵特有品种，为山东省传统名特蔬菜之一，是中国出口的优质大蒜。

苍山大蒜外贸出口已有20多年历史，远销日本、韩国、新加坡、马来西亚、柬埔寨、泰国等国家和地区。2016年“苍山大蒜”荣获农产品地理标志金奖，成为山东省唯一一个获得此奖项的产品。苍山大蒜基地现有面积2.4万hm2，东至临沂市兰陵县神山镇东杨庄村;西至向城镇杨庄村;南至长城镇前芦洼子村;北至大仲村镇泉汪村;辖10个乡镇560个行政村，地理坐标为117°56′～118°17′E、34°39′～34°59′N。年产量32万t。

苍山大蒜随着种植面积的逐年扩大，大蒜有害生物亦呈快速增加趋势，危害越来越大。在大蒜生长期间和仓储期间，有害生物的危害，造成蒜薹、蒜头减产和霉烂[2]。蒜头（大蒜鳞茎）在贮藏调运期间可发生多种病害，引起蒜头腐烂和污损，严重降低其商品价值和种用价值。大蒜鳞茎（蒜头）是重要的市场和产地检疫农产品[3]，蒜头病害还是出境植物检疫的重要对象，鳞茎腐烂是引起大蒜减产的主要因素[4]。因此，进一步加强大蒜贮藏期病害的研究有着重要的意义。本研究旨在通过对大蒜贮藏期蒜瓣新病害病原细菌的研究，为大蒜病害的防控提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 病害调查和样本采集

2016年1月至2017年11月对临沂市兰陵县大蒜贮藏期病害情况进行调查，发现苍山大蒜在贮藏期间发生较为严重的病害，对感病情况、病原种类及发生症状进行观察、记录和拍照。采集大蒜鳞茎样本650份，统计蒜头和蒜瓣感病率，并选取部分蒜瓣进行病原菌研究。

1.2 病原菌的鉴定

1.2.1 病原菌的分离和纯化 病原菌的分离采用内生细菌的分离方法进行分离，将得到的分离物分别编号，并置于细菌培养基上于37 ℃恒温培养1～2 d，在显微镜下观察，待单细胞形态特征完全一致时，即转接到细菌斜面培养基上进行培养，得到的菌株为纯菌株。

1.2.2 病原细菌的常规生理生化特性测定 传统形态和生理生化鉴定：通过革兰氏染色、观察形态和使用细菌微量生化鉴定管测定生理生化特性。根据《伯杰氏细菌手册》[5]和《常见细菌鉴定手册》[6]中的方法进行种类鉴定。细菌微量生化鉴定管购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2.3 致病性测定 分别以病原菌的菌落和孢子懸浮液作为接种体对其在蒜瓣上的致病性进行测定。选择健康的蒜瓣进行接种，蒜瓣先用70%的乙醇表面消毒，再分有伤口（用无菌新牙刷在蒜瓣表面刷3下）接种和无伤口接种，以清水为对照，接种后保湿24 h，每隔1～2 d观察症状。发病后，从病斑再次分离病原菌，并与原接种菌进行比较。Kock氏致病性测定参照Xie等的方法[7]进行。

1.2.4 病原菌的确认 蒜瓣组织解剖观察：选取含有病斑的蒜瓣，用清水冲洗干净，然后再用无菌水洗1～3遍，保证蒜瓣表面没有其他微生物和尘土颗粒附着。利用徒手切法，采用纵向和横向的方法切取病斑及其周围的组织，选取合适材料制成玻片，用于病原菌的显微观察和验证。

1.2.5 病原菌形态学的特征观察 病原菌的培养性状观察：将病原菌移接于PDA平板上，25 ℃培养7～8 d，记录菌落形态和颜色，观察其菌落特征和大小，并描述其菌落特征。

1.2.6 16S rDNA同源性分析 采用OMEGA细菌DNA提取试剂盒/Bacterial DNA Kit（50次）提取菌株基因组总DNA。本试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司。引物设计上游引物5′-GGATACCTTGTTACGACTT-3′和下游引物5′-AGAGTTTGATCCTGCCTCAG-3′，PCR扩增反应体系：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，引物各1.0 μL，DNA模板 5.0 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 12.5 μL。PCR产物经回收纯化后连入pMD19-T载体，热激法转化到E. coli DH5α感受态细胞，选择转化的阳性克隆提取质粒，由山东省农业科学院测序中心进行DNA双向测序。利用DNAMAN分析软件将待测菌株的16S rDNA核苷酸序列与GenBank上收录的代表菌株16S rDNA基因核苷酸序列进行同源性比对。结合DNAMAN、GenBank BLAST软件，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 蒜瓣的病害与症状特点

2016年1月至2017年11月对苍山县采收的新鲜大蒜、市售大蒜和仓储大蒜进行了抽样调查，调查发现储藏期大蒜蒜头病害种类复杂，病害发生较为严重，严重影响大蒜的质量和蒜农的收益。其发生规律和危害症状不尽相同。感病情况统计结果表明，蒜头感病率10%，蒜瓣感病率6%，真菌发病感病率95%，细菌感病率5%。从感病症状可知，蒜瓣病斑多呈干瘪、凹陷、水渍状，常覆盖绒毛或者粉状物，且颜色各不相同，有青色、黑色、白色、褐色等。发病蒜瓣有时散发恶臭味。总之，大蒜鳞茎受害后的症状因为病原物的不同各有不同。调查还发现，凡是感病蒜瓣多有机械损伤痕迹，由此说明贮藏期大蒜感病的主要原因是：蒜瓣自身在田间、运输或者贮藏过程受到了机械损伤，导致腐生菌寄生所致。造成根部腐烂的主要原因是根部带菌浸染，初侵染菌源多来自田间土壤;在贮运期间由根部蔓延到蒜头基部，蒜瓣变黄褐色、干枯。贮运病害发生的主要内在因素是蒜头内在质量较差，生活力降低或收获贮运期间受到机械损伤。大部分贮蒜病害的病原菌腐生性较强，分布很广，蒜头不论在田间还是在贮运过程中都要被病原菌污染，贮藏期间通风不畅，蒜头受潮发热，则是主要的外部因素。做好田间病害防治，保持贮运环境卫生，避免采收、运输和贮藏期机械损伤，减少菌源来源无疑是极其重要的。采收、贮运条件对蒜头病害的发生起着关键作用。

2.2 病原菌的鉴定

2.2.1 病原菌的分离和纯化 从兰陵县、临沂市场和超市采集样品650份，从中选取30个代表性蒜瓣，于PDA培养基平板上分离病原菌，25 ℃下培养，各标样均长出不同的菌落，通过菌落特征和显微特征观察，参照有关资料，将大蒜蒜瓣病斑分离物初步鉴定为5种，并分别编号为LYU20170011～LYU20170015，其菌落形态分别见图1-A至图1-E。初步拟定为：A曲霉Aspergilus sp.，B青霉Penicillium sp.，C芽孢杆菌Bacillus sp.，D、E镰刀菌Fusarium spp.。以上分离物的属种归属和致病性需要进一步验证。本研究只对芽孢杆菌Bacillus sp. LYU20170013菌株进行深入研究，其他分离物的致病性尚在研究之中。

2.2.2 理化性质的鉴定 从大蒜蒜瓣分离得到的12株菌株，在PDA或者牛肉膏蛋白胨细菌培养基上其菌落特征完全一致。菌落呈不规则状，有皱褶，边缘波纹状或者锯齿状，灰白色，革兰氏染色阳性，接触酶试验、木糖发酵、乳糖发酵、棉子糖发酵、硝酸盐还原试验均呈现阳性，V-P试验阳性，酪素水解试验、淀粉水解阳性，麦芽糖发酵试验和甘露醇发酵试验均呈现阳性，能在7% NaCl中生长，兼性厌氧。以上特征与解淀粉芽孢杆菌Bacillus sp.的理化性质最为类似，故将其拟定为解淀粉芽孢杆菌。

2.2.3 病原菌的确认 柯赫氏法则验证：将纯化后的细菌菌株LYU20170013重新接种到健康的大蒜蒜瓣上，回接在 35 ℃ 下恒温培养7～9 d，观察发现接种的大蒜蒜瓣全部发病，有刺伤的蒜瓣发病比无刺伤的蒜瓣早1～2 d，症状与田间观察到的相同，对照不发病（图2）。用发病的病斑进行常规分离，再次获得与原分离菌基本一致的病原菌，根据柯赫氏法则，证明接种菌即为大蒜蒜瓣的病原菌。

2.2.4 病原菌的形态特征 自然基质组织解剖观察：选取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水冲洗干净，再用70%的乙醇浸泡 1～3 min，无菌水洗1～3遍，保证叶片表面没有其他微生物和尘土颗粒附着。利用徒手切法，采用纵向和横向的方法切取病斑及其周围的组织，制备组织玻片，进行显微观察，结果如图3。从图3-A看出，病原菌短杆形，23 μm×（0.6～0.8） μm，单个细胞，着色均匀。感病蒜瓣组织解剖特征见图 3-B。病原分离物在PDA培养基上菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，菌落边缘不整齐或者呈锯齿状，培养基中生长时，常形成皱醭。菌落形态如图3-D，挑去菌落，制片观察，其显微特征如图3-C，从图3-C看出，其形态学特征与自然基质上图3-A的特征完全一致。

2.2.5 病原菌16S rDNA的序列分析及同源性比较 形态学特征是真菌传统分类的主要依据。但是，真菌形态学特征受培养基和基质的影响较大，所以单纯进行形态学分类还缺乏一定的科学性。为保证病原菌鉴定的准确性，本研究对得到的几种病原分离物进行了分子生物学辅助鉴定。对LYU20170013号细菌进行了16S rRNA序列测定。LYU20170013号菌株的PCR扩增產物经琼脂糖凝胶电泳检测如图4，得到1个大小约1 413 bp的片段基因序列。

将菌株LYU20170013的rDNA-ITS基因序列与GenBank中已有的DNA序列进行同源性比较，构建系统进化树。由图5可看出，与其同源性99%的菌株种类为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens（KR708881.1）、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（KF475836.1、JQ806052.1、FJ581439.1）、甲基营养型芽孢杆菌Bacillus mthylotrophicus（KX129838.1、CP009679.1、CP023320.1），从系统发育树可知，该菌与解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens（KJ77953.1）的遗传距离最近，再结合其形态学显微特征，最终确定该病原菌为解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens。

3 结论与讨论

通过对苍山大蒜贮藏期蒜头感病情况调查，发现蒜头感病率在10%以上 蒜瓣感病率在6%以上。选取代表性感病蒜瓣对病斑菌群进行了分析，共发现5种微生物，其中LYU20170013号菌株为解淀粉芽孢杆菌，其他菌株为真菌，它们分别为青霉、曲霉、变红镰刀菌、尖孢镰刀菌。本研究只对LYU20170013号菌株进行了详细研究，根据致病性测定和柯赫氏法则，结合形态学特征和分子生物学技术，最后确定病原LYU20170013号菌株为解淀粉芽孢杆菌，该菌在大蒜上尚属首次报道。其他真菌的致病性正在陆续研究之中。

大蒜病原物多为腐生真菌，少数为细菌，其菌群多为混合菌群。商鸿生等报道了大蒜红腐病的3种镰刀菌[8]。盛红梅等报道了甘肃省大蒜病害14种，其中真菌性病害9种，细菌性病害1种，主要包括：白腐病、白斑病、紫斑病、花叶病、黑头病、叶霉病、青霉病、煤斑病、锈病、软腐病等[9]。屈世喜报道山东鲁西南地区大蒜生长期主要病害有病毒病、锈病、叶枯病、叶斑病、菌核病、白腐病、细菌性软腐病等;贮藏期病害主要有青霉病、灰霉病、紫斑病等[10]。大蒜鳞茎细菌性腐烂病菌，除芽孢杆菌和欧文氏菌外，其余病原细菌在国内外尚未见报道[4]，但是，韩国的Qiu等报道在黑蒜加工过程中，大蒜内生枯草芽孢杆菌B. subtilis，甲基营养型芽孢杆菌B. methylotrophicus和解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens是分离得到的7种细菌中的优势菌群[17]。Kim等报道了Bacillus amyloliquefaciens MJ1-4发酵的Cheonggukjang（清麴酱）中大蒜β-葡萄糖苷酶活性、总酚含量、异黄酮含量及抗氧化活性的变化特点[18]。本研究在此基础上，确认了大蒜病原细菌LYU20170013号菌株的种类为解淀粉芽孢杆菌，该病原菌在大蒜上尚属首次报道。

大蒜真菌类疾病，主要危害近地面假茎基部或贮存的鳞茎。严重时影响大蒜的产量和质量。大蒜病害主要有大蒜叶枯病、大蒜茎腐病、大蒜紫斑病、大蒜细菌性软腐病、大蒜灰霉病、大蒜锈病及大蒜病毒病等[11]。本研究首次报道大蒜鳞茎的新病害，病原物为解淀粉芽孢杆菌。

大蒜为百合科葱属多年生草本植物，是各国人民喜爱的香辛类蔬菜，在世界各地普遍种植。大蒜不仅是人们常用的安全无毒、无公害、无残留的调味品，而且是成本低、无毒、无副作用、具有独特的药理和营养保健功能，可以有效地预防癌症的发生[12-15]。大蒜由于具有较高的营养保健和药用价值而成为国际研究的热点[16]。解淀粉芽孢杆菌是具有良好生物防治功能的益生菌，广泛应用于植物病原真菌和细菌的防治[17]，其功能基因组、蛋白组和代谢组学的研究已取得了一定的进展，有关其分类学鉴定、抗菌物质、抗菌机制以及与植物互作、食品领域和动物领域的应用等方面的研究亦较多[18-25]。本研究主要目的是摸清苍山大蒜贮藏期鳞茎发病的原因和病原物的种类、致病性及其侵染机制，为大蒜病害的防治提供技术支持和理论指导。在本研究的基础上，有望在不远的将来开发出能够有效控制大蒜储藏期病原菌解淀粉芽孢杆菌的防控技术。

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