血红铆钉菇子实体化学成分GC-MS分析及石油醚萃取物抗肿瘤活性组分筛选

都君 张红 陈屏

摘要：为了分析血红铆钉菇子实体的化学成分并对其石油醚萃取物进行抗肿瘤活性筛选。试验采用气相色谱-质谱联用法（GC-MS），通过硅胶柱层析对石油醚萃取物进行组分分离，采用CCK-8法测定各组分对人肺癌细胞（NCI-H460）和人胃癌细胞（SGC-7901）的增殖抑制作用。结果表明，从血红铆钉菇子实体中共鉴定出60个化合物，占提取物总量的96.074%。主要以烷烃类、醛酮类、酯类、脂肪酸类为主，分别占13.503%、17.317%、17.777%、25.738%。石油醚萃取物经硅胶柱层析分离共得8个组分（A、B、C、D、E、F、G、H），其中组分（A、B、C、H）对人肺癌细胞（NCI-H460）有增殖抑制作用，组分（A、B、C、F、H）对人胃癌细胞（SGC-7901）有增殖抑制作用，并均呈浓度依赖性。组分（A、B、C、H）对人肺癌细胞（NCI-H460）的IC50分别为790.46、842.05、876.12、1 479.55 μg/mL，组分（A、B、C、F、H）对人胃癌细胞（SGC-7901）的IC50分别为619.29、465.45、1 137.88、1 096.11、754.48 μg/mL。说明通过对血红铆钉菇子实体GC-MS分析及抗肿瘤活性筛选，石油醚萃取物组分（A、B、C、F、H）具有一定的抗肿瘤活性，可能含有抗肿瘤活性的单体化合物。

关键词：血红铆钉菇;气相色谱-质谱;细胞增殖;脂肪酸;硅胶柱色谱;癌细胞

中图分类号： O657.63  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0197-04

血红铆钉菇[Chroogomphus rutilus （Schaeff.） O. K. Mill.]属担子菌亚门牛肝菌目铆钉菇科（Gomphidiaceae）铆钉菇属（Chroogomphus），分布于中国（吉林、黑龙江、辽宁、河北、山西、云南、四川、西藏、广东、湖南等地区）、日本、欧洲及北美等地[1]，主要生长于北温带[2]。其子实体呈铆钉状且菌肉为酒红色，故名血红铆钉菇。在我国东北地区俗称松树伞、松蘑、红蘑、松树钉、肉蘑、鸡血蘑[3]，其营养价值极高，深受人们喜爱，是现今仍不能人工驯养的野生食用菌珍品[4]。此外，血红铆钉菇具有很好的药理活性，具有神经元保护作用，抗氧化、抗病原菌作用，促生长等功效，还具有降血糖和抗癌等作用[5-6]。因此，血红铆钉菇具有很大的开发价值。本试验通过气相色谱-质谱技术对血红铆钉菇化学成分进行分析研究及抗肿瘤活性的筛选，为血红铆钉菇的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

试验于吉林农业大学教育部食药用菌工程研究中心（2015年12月至2017年12月）进行。血红铆钉菇干品由吉林农业大学中药材学院包海鹰教授鉴定。

气相色谱-质谱联用仪，旋转蒸发仪RE-5210（上海亚荣生化仪器厂），循环水式多用真空泵S-B95A（湖南省巩义市英峪仪器厂）、电子天平AL-104[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、恒温水浴锅HH4（金坛市江南仪器厂）、CO2培养箱 BPN-80CH型（上海一恒科学仪器有限公司）、680型酶联免疫酶标仪（美国Bio Rad公司）、离心机TD4ZWS（上海安亭科学仪器制造厂）、XD-101型倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司）。

细胞增殖和细胞毒性试剂盒CCK-8（广州贝博生物科技有限公司）、0.25%胰蛋白酶（上海索莱宝生物科技有限公司）、乙醇和石油醚（分析级，北京化工厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 气相色谱-质谱分析条件 （1）气相色谱条件。色谱柱：DB-5型石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 nm）;升温程序：起始温度8 ℃，升温速率1 ℃/min，升温至15 ℃，升温速率至3 ℃/min，升温达到250 ℃，升温速率达到 10 ℃/min，待温度升高到280 ℃时持续5 min;氮气流速为1.0 mL/min;分流比为50 ∶ 1。（2）质谱条件。质量扫描范围：质荷比20～880;电子轰击离子源;电子能为70 eV;电压为 0.75 kV;电子源温度为2 ℃。

1.2.2 CCK-8法抗肿瘤活性组分筛选 （1）样品制备 血红铆钉菇干品粉碎，95%乙醇按1 ∶ 4（体积分数）量回流提取2次，每次3 h，合并提取液，减压浓缩得乙醇浸膏。乙醇浸膏挥干后加蒸馏水混悬，加入石油醚按1 ∶ 1（体积分数）量萃取，石油醚萃取物减压浓缩得石油醚浸膏。将石油醚浸膏用丙酮溶解，与硅胶（100～200目）按1 ∶ 2伴样，干法上硅胶柱（73 mm×305 mm），流动相为石油醚-乙酸乙酯[A（9 ∶ 1）、B（8 ∶ 2）、C（7 ∶ 3）]，四氯甲烷-甲醇[D（10 ∶ 0）、E（9 ∶ 1）、F（8 ∶ 2）、G（7 ∶ 3）、H（0 ∶ 10）]，合并相同比例組分，减压浓缩，共得8个组分（A、B、C、D、E、F、G、H）。（2）抗肿瘤活性筛选 采用CCK-8法，以人肺癌细胞（NCI-H460）和人胃癌细胞（SGC-7901）为受试对象。取2种细胞的对数生长期细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，计数，分别配成细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔加细胞悬液100 μL（细胞密度分别为 6.00×103、3.25×104个/mL），置37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。24 h后试验组分别加入配制好的8个组分（A、B、C、D、E、F、G、H）10 μL，浓度梯度分别为400.000 0、200.000 0、100.000 0、50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5 μg/mL。每个梯度设6个重复。空白组为100 μL培养液，对照组为100 μL细胞。置37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养。24 h后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂盒，培养3 h后，用海标仪在 450 nm 波长下测定D值。抑制率计算公式为抑制率=1-[（实验组-空白组）/（对照组-空白组）]×100%。

2 结果与分析

2.1 血红铆钉菇子实体GC-MS分析结果

对血红铆钉菇子实体进行GC-MS分析，其总离子流图如图1所示，通过NIST库进行自动检索与标准物质谱图进行对比分析，并结合质谱裂解规律确定其化学成分。从血红铆钉菇子实体中分析出60个化合物（表1），且以烃类，醛酮类、酯类、脂肪酸类为主，分别占13.503%、17.317%、17.777%、25.738%，占检识出总量74.335%。血红铆钉菇子实体中以脂肪酸为主要成分，含量较多的是正戊酸（11.236%）、十六烷酸（4.020%）、十四烷酸（2.055%）、十五烷酸（1.388%）。

2.2 抗肿瘤活性组分筛选

2.2.1 血红铆钉菇石油醚萃取物各组分对人肺癌细胞（NCI-H460）增殖的抑制作用 由表2可知，血红铆钉菇石油醚萃取物8个组分中，组分A、B、C、H对人肺癌细胞 NCI-H460 的增殖具有明显的抑制作用，在浓度 400 μg/mL 时抑制率最大，分别为38.99%、31.52%、29.72%、23.37%。且组分A、B、C、H的抑制率随剂量的增加而提高，具有良好的剂量-效应关系。通过SPSS计算其IC50分别为790.46、84205、876.12、1 479.55 μg/mL。而组分D、E、F、G没有明显的增殖抑制作用。

2.2.2 血红铆钉菇石油醚萃取物各组分对人胃癌细胞（SGC-7901）增殖的抑制作用 由表3可知，血红铆钉菇石油醚萃取物8个组分中，组分A、B、H对人胃癌细胞SGC-7901的增殖具有明显的抑制作用，在浓度为 400 μg/mL 时，抑制率最大，分别为43.27%、47.74%、41.22%。组份C、F也具有一定的增殖抑制作用，在浓度为400 μg/mL时，抑制率分别为29.19%、33.49%。且组份A、B、C、F、H的增殖抑制作用均随剂量的增加而提高，具有良好的剂量-效应关系。通过SPSS计算其IC50分别为619.29、465.45、1 137.88、1 096.11、754.48 μg/mL，而组份D、E、G并没有明显的抑制作用。

3 讨论

本试验通过GC-MS分析了血红铆钉菇子实体中的挥发性成分，共鉴定出60个化合物，以烷烃类、醛酮类、酯类、脂肪酸类为主，分别占13.503%、17.317%、17.777%、25.738%，占检识出总量74.335%。其主要成分为正十七烷（2.594%）、甲基庚烯酮（2.835%）、硬酯酸异丁酯（7.563%）、正戊酸（11.236%）、十六烷酸（2.844%）。有研究表明脂肪酸具有抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗氧化等作用[7]。血红铆钉菇具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、促生长、神经元保护等多种药理活性，而这些生物活性与其具有丰富的脂肪酸类化合物可能有着一定的联系[8-12]。

采用硅胶柱层析对血红铆钉菇石油醚提取物进行分离，得到8个组分。通过CCK-8法测定各组分对人肺癌细胞（NCI-H460）和人胃癌细胞（SGC-7901）的增殖抑制作用，其中组分A（石油醚 ∶ 乙酸乙酯=9 ∶ 1）、B（石油醚 ∶ 乙酸乙酯=8 ∶ 2）、C（石油醚 ∶ 乙酸乙酯=7 ∶ 3） 、H（四氯甲烷 ∶ 甲醇=0 ∶ 1）对2种肿瘤细胞均具有比较明显的增殖抑制作用，组分F（四氯甲烷 ∶ 甲醇=8 ∶ 2）对人胃癌细胞（SGC-7901）具有一定的增殖抑制作用，而对人肺癌细胞（NCI-H460）无明显效果。组分D（四氯甲烷 ∶ 甲醇=1 ∶ 0）、E（四氯甲烷 ∶ 甲醇=9 ∶ 1）、G（四氯甲烷 ∶ 甲醇=7 ∶ 3）对2种细胞均无明显抑制效果。可以说明组分A、B、C、F、H為抗肿瘤活性组分，可能含有抗肿瘤活性的单体化合物，有待进一步开发研究。

参考文献：

[1]周崇莲，韩桂之，周玉芝，等. 几种松树外生菌根真菌的研究[J]. 生态学报，1983，3（2）：103-109.

[2]刘志民. 现代实用毒物分析[M]. 北京：人民卫生出版社，1984：347-348.

[3]陈添兴. 南京紫金山大型菌物多样性研究[D]. 南京：南京师范大学，2012.

[4]卯晓岚. 食用珊瑚菌[J]. 中国食用菌，1987（1）：22-24.

[5]戴玉成. 中国东北野生食药用真菌图志[M]. 北京：科学出版社，2007.

[6]刘钟栋. 食品添加剂[M]. 南京：东南大学出版社，2006：221.

[7]胡 锐，李宝莉. 传统药物中脂肪酸的药理活性和现代研究[J]. 中外医疗，2008（27）：135-136.

[8]祝鹤鸣，吴艳玲，李 雪，等. 血红铆钉菇子实体对人肝星状细胞LX-2和人肝癌细胞Hep G2增殖的影响[J]. 安徽农业科学，2013，41（15）：6651-6653.

[9]张雪倩，孙 红，王立安，等. 色钉菇粗多糖对小鼠DA能神经元MPTP损伤的保护作用[J]. 菌物学报，2011，30（1）：77-84.

[10]Sun Y X，Liu J C，Kennedy J F. Extraction optimization of antioxidant polysaccharides from the fruiting bodies of Chroogomphis rutilus （Schaeff.：Fr.） O. K. Miller by Box-Behnken statistical design[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：209-214.

[11]栾庆书，金若忠，云丽丽，等. 血红铆钉菇对土传病原菌抑菌性研究[J]. 辽宁林业科技，2005（6）：13-16，55.

[12]李艳红，姜 勇，王文杰，等. 有机碳和无机碳对3种真菌胞外酸性磷酸酶和蛋白酶活性的影响[J]. 植物研究，2013，33（4）：404-409.