基于线粒体COⅠ基因序列分析5个巨魾群体的遗传多样性

牛宝珍 李娜 刘艳红 王兴龙 陈春丽 文天仙 周亚 杜民

摘要：采集云南省5个不同地域的巨：红河曼耗（M）、怒江下游（N）、怒江坝（B）、澜沧江上游（L）、景洪（J）各12尾巨共计60个样本进行CO Ⅰ基因克隆测序。结果表明，5个巨群体的T、C、A、G 4种碱基平均含量如下：怒江坝（B）群体T、C、A、G碱基含量分别为274%、27.6%、28.0%、17.0%，景洪（J）群体T、C、A、G碱基含量分别为274%、27.6%、28.0%、17.0%，澜沧江上游（L）群体T、C、A、G碱基含量分别为27.4%、27.6%、28.0%、17.0%，红河曼耗（M）群体T、C、A、G碱基含量分别为27.3%、27.6%、28.1%、17.0%，怒江下游（N）群体T、C、A、G碱基含量分别为27.3%、27.6%、28.2%、16.9%;5个巨群体的A+T含量均大于C+G含量。用MEGA 5.0软件构建5个群体系统进化树显示景洪和红河曼耗聚为一支，澜沧江上游大多数个体单独聚为一支，怒江坝和怒江下游群体混合聚为一支;曼耗和景洪的群体间遗传距离（9.096）最大，本研究结果可为巨的资源保护提供依据。

关键词：云南省;巨;CO Ⅰ基因;遗传多样性

中图分类号： S917.4  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0056-03

巨（Bagarius yarrelli）分布于中国云南的怒江、澜沧江和元江水系，隶属于硬骨鱼纲（Osterichthyes）、鲇形目（Siluriformes）、科（Sisordae）、属（Bagarius）[1]。巨是产地的主要食用鱼类[2]。目前，对于巨鱼的研究主要包括巨的生物学特性[2]和野生巨的生物学特性[3]、食性[4]、人工繁殖与胚胎发育[5]和巨细胞色素氧化酶基因多态性及系统进化的研究[6]、巨野生群体遗传多样性的RAPD分析[7]、巨线粒体DNA ND6基因克隆及多态性分析[8]、巨鱼线粒体12S rRNA和16S rRNA基因克隆及多态性分析[9]。

随着分子生物学技术的不断进步，目前各种分子标记已被广泛应用于各种生物的分子系统分类和物种鉴定研究，其中线粒体CO Ⅰ基因序列是最常用的分子标记之一[10]。Hebert等提出了利用线粒体细胞CO Ⅰ基因的部分序列建立全球动物的DNA条码（DNA barcode）标准数据库，从而进行物种简单有效的识别和鉴定工作[11]。区别于传统的形态学鉴定方法，DNA条形码技术更加简单有效且不受人为和客观因素的影响，因为DNA条形码技术是直接用碱基顺序来反映物种的客观指标，对于不同地域鱼类的遗传和进化关系的鉴定更为简单有效[12]。单云晶等利用线粒体CO Ⅰ基因序列对5个不同的鲤养殖品进行遗传多样性分析[13];曹艳等基于线粒体CO Ⅰ基因序列对分布于渤海、黄海、东海和南海海域的6个群体蓝点马鲛遗传多样性进行了比较[14];线粒体CO Ⅰ基因序列对于鸟类的系统分类也有很好的依据性，李涛等对雀科13属36种鸟类的CO Ⅰ基因部分序列初步分析了雀科鸟类之间的系统发育关系[15];这些研究都表明线粒体CO Ⅰ基因序列对于物种的分类以及不同地理位置的同一物种的进化关系都是简单且有效的手段。由于现代工业化的加快，缺乏物种的保护，巨鱼数量减少，已被列入云南省水生野生动植物保护名录[16]。为保护巨群體的多样性，对不同巨群体在分子水平上进行遗传多样性研究，为今后建立基于DNA分子标记的巨物种提供资料基础。本试验选用来自澜沧江上游（L）、怒江坝（B）、红河曼耗（M）、景洪（J）以及怒江下游（N）不同群体的巨作为试验材料，采用基因克隆方法获得线粒体CO Ⅰ基因全序列进行分析，构建系统进化树，探讨不同巨群体的遗传和进化关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用2013年10月至2017年6月采自中国云南临沧市澜沧江上游（L）、西双版纳傣族自治州景洪市（J）、红河曼耗江段（M）、怒江傈僳族自治州怒江坝大桥（B）以及怒江傈僳族自治州三江口怒江下游（N）的巨各12尾，依次编号为 1～12，取其背部肌肉组织放入1.5 mL EP管中并浸入无水乙醇，做好标记置于冰箱-20 ℃保存。

1.2 试验方法

采用酚-氯仿方法[13]提取巨基因组DNA，1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测后经凝胶成像系统进行拍照并保存在 -20 ℃ 冰箱。巨PCR扩增所用的引物为杜民等[17]设计合成的1对简并引物，其名称和序列分别为Baya09F：5′-GAGTGAAAAYCTCCTAGTCYCT-3′，Baya09F：5′-GTTTCTCATTTAATWGAKCCTCC-3′，经过琼脂糖凝胶检测的目的PCR产物利用凝胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司）回收、纯化、连接转化后，利用通用M13引物进行菌液PCR后将筛选后的阳性克隆样品送至上海生物工程有限公司进行测序。

1.3 数据处理

测序结果利用DNAMAN 5.2.2软件进行比对，采用DnaSP 5.10.01软件分析核苷酸序列，采用MEGA 5.0软件对序列的碱基含量、转换和颠换比分析并构建系统进化树。

2 试验结果

对测序的结果用DNAMAN 5.2.2软件对60个巨的核苷酸序列进行比对并用DNAsp[18]软件比对后发现在5个群体60个样本序列共存在59个单倍型，其中怒江下游12个序列存在11个单倍型，其余4个群体的12个序列均发现12个单倍型;利用MEGA 5.0[19]软件中的Kimura双参数模型[20]分析5个巨群体之间的碱基转换/颠换（R）的范围在 0.691～31.798，5个群体之间碱基的平均转换/颠换比值范围为 2.864～9.096。60个体CO Ⅰ基因序列的全长为 1 551 bp，保守位点1 144个、变异位点428个、简约信息位点267个、单态突变位点160个。5个巨群体碱基组成百分比结果见表1。

利用MEGA 5.0软件中Kimura 2-parameter model参数对本研究5个群体60个巨CO Ⅰ基因核苷酸序列分别进行群体内和群体间的遗传距离分析，群体间平均遗传距离见表2，右上角为转换+颠换（Ts+Tv），群体间平均遗传距离左下角为转换/颠换（Ts/Tv）。

本研究选择斑马鱼（Danio rerio）作为外群，NCBI上面的登录号为NC_002333。 利用5个群体60尾巨和斑马鱼基于Kimura双参数模型建立的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）系统进化树见图1。

3 讨论

3.1 巨CO Ⅰ基因碱基组成

线粒体基因属母系遗传且稳定，线粒体CO Ⅰ基因既有足够的变异，又便于PCR扩增，使其成为DNA条形码基因之一[21-22]，利用其核苷酸序列的差异，可以进行物种鉴别、遗传及进化关系分析，被广泛应用于鸟类、鱼类、昆虫和动物的鉴别[23]。本研究采用基因克隆测序方法比较了云南省内3个河流5个不同群体（M-红河曼耗、N-怒江下游、B-怒江坝、L-澜沧江上游、J-景洪），各12尾巨共计60个样本的线粒体CO Ⅰ基因全长序列的碱基组成和单倍型进行分析。结果表明，巨线粒体CO Ⅰ基因核苷酸序列长度为 1 551 bp，其保守位点1 144个、变异位点428个、简约信息位点267个、单一突变位点160个。5个群体巨A+T的含量（55.5%）明显高于C+G的含量（44.5%），G含量（17.0%）最低，这与单云晶等的研究结果[14]一致。从原核生物到真核生物，其CO Ⅰ基因组中碱基A+T高的现象广泛存在，这一现象的产生与基因长度以及密码子反密码子间结合能力的大小有关[24]。

3.2 基于CO Ⅰ基因的不同巨群体的亲缘关系

5个群体中每12个个体中得到的单倍型除了怒江下游（N）群体为11个单倍型外，其余4个群体各得到12个单倍型，60个个体共得到59个单倍型，这可能是由于本试验利用的是CO Ⅰ基因的全长序列而不是特定的条形码所需的部分序列（648 bp）[22];5个群体的单倍型不存在共享的情况，表明5个巨鱼群体的遗传多样性较高。不同群体的单倍型个体在系统进化树上交织在一起，其中怒江坝（B）群体和怒江下游（N）交叉最为严重，这一结果与董新培等在日本沼虾群体中的研究结果[25]相一致。红河曼耗（M）群体和景洪（J）群体和另外其他3个不存在交叉情况，且红河曼耗（M）群体和景洪（J）群体的遗传距离较小。5个群体中怒江坝（B）群体和怒江下游（N）群体聚为一支、红河曼耗（M）和景洪（J）聚为一支;澜沧江上游（L）单独为一支并且靠近怒江坝（B）和怒江下游（N）的分支，这可能与其不同流域的基因交流有关系。巨是分布在东南亚的越南、柬埔寨、缅甸、印度及中国云南的元江（红河）、澜沧江和怒江的底栖性鱼类，由于味道鲜美而受到当地居民的喜爱，本研究中的巨1个群体来自红河的曼耗段（M），而红河最终经过中国的河口流向越南后最终到达北部湾，2个群体来自澜沧江的澜沧县段（L，澜沧江上游）和景洪段（J），而最终经过缅甸、老挝、泰国、柬埔寨、越南后进入南海，2个群体来自怒江的潞江坝段（B）和三江口段（N，怒江下游），怒江经由缅甸后流入印度洋;这样的地理状况为巨群体间的基因交流提供了可能性。怒江坝、景洪、澜沧江上游、曼耗、怒江下游同一群体内的遗传距离分别为4.629、4.000、2.697、3.427、6.718，以怒江下游群体内的遗传距离最大。遗传距离越大表明该群体内的遗传多样性越丰

富，本研究中怒江下游群体的遗传多样性最丰富、怒江坝群体次之、澜沧江上游群体的遗传多样性最小。遗传多样性的丰富程度表明了这个生物群体对于外界环境的适应能力，本研究的结果可为巨的遗传资源保护提供分子方面的依据。

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