生物炭对杉木人工林土壤养分、酶活性及细菌性质的影响

胡华英,殷丹阳,曹 升,张 虹,周垂帆,3,*,何宗明

1 福建农林大学林学院,福州 350002 2 国家林业和草原局杉木工程研究中心,福州 350002 3 福建长汀红壤丘陵生态系统国家定位观测研究站，龙岩 366300

杉木[Cunninghamialanceolata(Lamb．)Hook．]是重要速生用材树种,广泛分布于我国南方地区,在亚热带森林生态系统中占有十分重要的地位,然而杉木连栽地力衰退日趋突出,土壤性质退化,肥力和林分生产力下降,土壤酶活性逐渐下降[1],土壤细菌群落多样性低下[2],对森林生态系统产生不利影响,严重威胁南方地区人工林的可持续经营。近年来有研究发现,添加生物炭能够改善土壤团聚体结构和土壤理化性质,提高土壤肥力[3],能够提供土壤细菌适宜的栖息环境,刺激土壤细菌功能和群落多样性的变化[4],还可以影响土壤酶活性[5]。Lehmann等[6]表示对土壤添加生物炭能够促进细菌与其他菌根形成共生体,对改善土壤生态系统中细菌多样性具有潜在的重要作用；Yang等[7]研究发现生物炭一方面可以为土壤细菌提供丰富的营养物质,另一方面为细菌提供适宜的庇护环境,从而能够促进土壤细菌的相对丰度；Oleszczuk等[5]通过对蔬菜地土壤添加生物炭发现,生物炭对酶活性具有保护作用,能够提高土壤中大部分酶的活性；邹春娇等[8]研究发现,生物炭处理能显著增加黄瓜连作营养基质中的酶活性,并且对微生物数量及群落结构也有明显的调节作用；Xie等[9]研究发现,对土壤添加生物炭能够增加土壤C、N含量,降低尿素氮,从而促进土壤养分循环和作物生长。因此,开展对土壤生物炭的环境效应研究,对改良土壤理化性质及提高土壤肥力,提升林木生产力等,都具有重要的理论和实践指导意义。但目前这些研究多聚焦于于农业土壤,而生物炭对林地土壤改良的研究报道国内并不多见,特别是生物炭对南方红壤杉木人工林细菌多样性、酶活性以及养分方面的作用机制的研究鲜有报道,这极大限制了生物炭在林业生产当中的应用,就亟需大量添加不同生物炭对红壤性质、细菌及酶活性影响的研究数据,以揭示杉木人工林土壤养分含量、细菌相对丰度及酶活性之间的相关关系。

有鉴于此,本文基于高通量测序技术,通过添加不同生物炭对人工杉木林土壤环境中细菌群落进行培养和测定,同时挑选与土壤C、N循环相关的土壤-α-葡萄糖苷酶、土壤-β-葡萄糖苷酶、土壤过氧化氢酶及土壤脲酶,分析四种酶活性与土壤养分含量及土壤细菌相对丰度的关系。通过研究添加生物炭对土壤细菌多样性及酶活性的影响,能够明确生物炭对杉木人工林土壤微生物群落结构的作用,更加准确地分析酶活性与土壤养分含量及细菌相对丰度之间的作用机制,为生物炭在南方酸性林地土壤的合理利用提供依据,对提高林木生产能力等具有重要的科学价值和现实意义。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区三明市位于福建省中西北部,年平均气温19.4℃,年平均降水量1500.7mm,相对湿度79%,日照率44%,土壤类型为山地红壤(富铝湿润富铁土),研究所用土壤采自三明市福建农林大学莘口教学林场(118°47′E,26°28′N),为二代杉木人工林土壤,在20m×20m的样方内按S形取多点0—20cm的土壤样品,混合鲜土过2mm筛之后风干保存,供土壤培养实验。杉木林土壤全磷(321±72.9)mg/kg、有效磷(14.03±2.42)mg/kg、pH(4.34±0.06)、全氮(1.83±0.20)g/kg、全钾(23.83±3.01)g/kg。

1.2 生物炭制备和性质

原料采自杉木树干和树叶,洗涤烘干粉碎后过1mm筛,置于马弗炉中进行厌氧热解,以20℃/min的速率分别加热至300℃、600℃,热解持续时间为4h,热解结束待其自然冷却至室温后置于棕色瓶中[10],得到4种生物炭,即300℃杉叶炭(BL300)、600℃杉叶炭(BL600)、300℃木屑炭(BW300)及600℃木屑炭(BW600)。制备完成后的生物炭测定其pH值(分别为7.33、10.41、4.05、7.96)、灰分(分别为9.9%、22.2%、1%、2.7%)、有效磷(分别为2568、3604、228、615mg/kg)、全碳(分别为563.1、592.6、592.4、676.6 mg/kg)、全氮(分别为15.7、12.8、3.9、3.5 mg/kg)等理化性质。

1.3 实验处理

向土壤中分别添加1%、3%比例的四种生物炭培养80天,设置9个处理：1)未处理土壤CK、2)土壤加1% BL300、3)土壤加3% BL300、4)土壤加1% BL600、5)土壤加3% BL600、6)土壤加1% BW300、7)土壤加3% BW300、8)土壤加1% BW600、9)土壤加3% BW600,每个处理设置3个重复。设置黑暗、25℃培养,培养期间每隔2—3d称重补水,使土壤水分保持在田间持水量的60%,培养时间为80天。

1.4 土壤理化性质测定方法

1.5 土壤酶活性测定方法

1.6 土壤微生物测定方法

细菌丰度及多样性的测定样本取自培养实验第80天的土壤,选取添加量为3%的4种的生物炭处理和对照土壤进行测定,每个处理设置3个重复。16S rDNA PCR产物高通量测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成,从样本中提取基因组DNA后,用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4区。引物序列为341F(CCTACGGGNGGCWGCAG),06R(GGACTACHVGGGTATCTAAT)；扩增体系为50 μL反应体系中包含5 μL的10× KOD Buffer,5 μL的2.5 mmol/L dNTPs,1.5 μL引物(5 μmol/L),1 μL的KOD聚合酶和100 ng模版 DNA；扩增条件为95 °C预变性2min,随后 98 °C 变性10 s,62 °C 退火 30 s,68 °C 延伸30 s,共27个循环,最后68 °C 延伸10min,然后将PCR扩增产物切胶回收,用QuantiFluorTM荧光计进行定量。将纯化的扩增产物进行等量混合,连接测序接头,根据Illumina官方说明构建测序文库,Hiseq2500的PE250模式上机测序,测定土壤细菌群落的相对丰度。

1.7 数据处理分析

土壤细菌测序得到原始数据后,对原始数据的reads利用、tags拼接等多个过程进行质控,根据PE reads之间的重叠关系,使用FLASH(v 1.2.11)将成对双端reads拼接为一条序列。拼接后的Raw Tags经过更严格的过滤处理得到高质量的Tags数据,并进行Tags截取、长度过滤等操作[14]。最后对处理后得到的Tags序列与数据库进行比对检测嵌合体序列[15],去除其中的嵌合体序列[16],得到最终的有效数据。测得土壤养分性质和土壤酶活性原始数据,通过Excel 2003整理数据,采用SPSS 19.0软件对土壤基本性质、酶活性实验数据进行单因素方差分析和SNK法进行显著性检验,得到数据均值及误差,运用双变量相关将土壤性质和酶活性及细菌相对丰度数据做相关性分析,运用Origin 8.5绘制土壤基本养分和酶活性柱状图,利用Canoco 4.5对土壤性质和养分含量及土壤细菌群落相对丰度做冗余分析(RDA),得到其中的相关关系。

2 结果与分析

2.1 生物炭对土壤化学性质影响

图1 不同生物炭处理土壤pH及养分变化Fig.1 Changes of soil pH and nutrients in different biochar treatmentsBL300：300℃杉叶炭处理；BL600：600℃杉叶炭处理；BW300：300℃木屑炭处理；BW600：600℃木屑炭处理

对培养80天的土壤测定理化性质,如图1所示,土壤全磷、有效磷、速效钾含量的变化趋势总体表现出相似性,杉叶炭处理之间变化显著,BL600处理显著高于BL300处理,且随着生物炭添加量增加而升高,而木屑炭处理变化不显著。所有处理的土壤pH值介于3.97—5.54之间,与对照相比,1%生物炭添加量的BL600比对照大,其他1%添加量均小于对照,其中1% BW300比对照低0.26,除了BW300其他3%生物炭添加量均大于对照,3%添加量的BL600处理的pH值高达5.54,比对照高出1.31,说明土壤pH值随着生物炭添加量增加而升高。添加生物炭后,土壤铵态氮含量随生物炭施用比例的增加而显著降低,各处理间变化显著,较小施用量条件下铵态氮含量增幅较为明显,两种形态的氮含量大致呈相反的趋势。添加生物炭后使土壤全碳含量均显著高于对照,且随生物炭施用比例的增加而显著提高,其中以3%添加量的BW600土壤全碳含量为最高,达到了44.3g/kg；而土壤溶解性有机碳含量并无明显变化规律,仅随生物炭添加量的增加大致呈降低的趋势。

2.2 生物炭对土壤酶活性影响

对添加不同生物炭所测得的4种酶活性变化进行分析,如图2所示,除了3%添加量的BW600表现为抑制,添加其他生物炭提高土壤-α-葡萄糖苷酶活性,在杉叶炭处理中1%添加量BL600高于BL300,且低添加量的酶活性大于高添加量；与对土壤-α-葡萄糖苷酶的活性影响不同,除了3%添加量的BL600和BW300表现为抑制,添加其他生物炭提高土壤-β-葡萄糖苷酶活性,其中杉叶炭中,低添加量酶活性大于高添加量,而添加木屑炭的土壤-β-葡萄糖苷酶活性变化规律不明显；添加生物炭对土壤过氧化氢酶活性影响不大,各处理酶活性相对一致；添加生物炭对脲酶活性大致表现为提高的趋势,且随添加量的增大而提高,其中3%添加量的BL600达到了极显著水平(208.13 μmol d-1g-1),而其他生物炭处理的土壤酶活性变化相对较小。

图2 不同生物炭处理对土壤酶活性影响Fig.2 Effects of different biochar treatments on soil enzyme activities

2.3 生物炭对土壤细菌丰度及结构的影响

土壤细菌群落shannon指数箱线图可以直观的反映添加不同生物炭后土壤细菌多样性的中位数、最大值、最小值及异常值等,如图3所示,不同处理表现出的结果有所差异,通过中位数可以看出,添加不同生物炭土壤细菌丰度BL300>BL600>CK>BW300>BW600,与对照相比,添加杉叶炭显著提升了土壤细菌丰度,添加木屑炭则抑制了土壤细菌类群的丰度；且添加300℃制备生物炭的土壤细菌丰度要高于600℃生物炭,其中BL300的土壤细菌丰度最大,而BW600的土壤细菌丰度最小；由图中还可以看出BL300、BW300测定的细菌丰度较为均匀、误差较小,而另外3种处理最大值和最小值相差较大从而误差较大。

图3 不同生物炭处理细菌群落shannon指数箱线图Fig.3 Shannon index box diagram of bacteria communities under different biochar treatments

选取土壤细菌优势种的部分分类单元,构建土壤细菌的系统发育分类树,可以清晰地看出土壤细菌群落不同分类水平上的结构和相对丰度,图4中从左到右的列分别代表由门到种的不同分类水平,各个饼图中不同的颜色的区域代表不同的处理在该分类单元上的比率,半径的大小代表该分类单元所包含的物种丰度,半径越大代表物种丰度越高。在门分类水平上的土壤优势菌中,放线菌门(Actinobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)在添加杉叶炭中占比例较低,而在木屑炭中占比较高；浮霉菌门(Planctomycetes)在添加BL600中占含量较高；变形菌门(Proteobacteria)在添加BL300占含量较高。在纲分类水平上的优势菌中,添加BL600的土壤中放线菌纲(Actinobacteria)和纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)的含量较低,而在其他细菌中所占的含量较高,其他处理中细菌相对丰度差异不显著；在属分类水平上的优势菌中,嗜酸栖热菌属(Acidothermus)在添加杉叶炭中占含量极低,在添加木屑炭处理中含量较高,其中在BL600含量最低,而BW300中含量最高,中华单胞菌属(Sinomonas)在BW300中相对丰度最高。

图4 不同生物炭处理下土壤细菌系统分类树Fig.4 Soil bacterial taxonomy tree under different biochar treatments

2.4 土壤养分、酶活性及细菌丰度之间的冗余分析

对土壤性质与土壤酶活性及细菌优势物种丰度进行冗余分析,如图5所示,a图代表土壤性质与门分类水平上土壤细菌及酶活性的冗余分析,b图代表土壤性质与属分类水平上土壤细菌及酶活性的冗余分析,粗线箭头代表土壤性质及化学组分含量,箭头越长代表影响越显著,可见土壤pH、全磷、硝态氮、铵态氮及DOC含量为主要影响因子,而全碳、有效磷及速效钾对土壤细菌的影响较小；细线箭头代表土壤4种酶活性和在不同分类水平上土壤优势细菌群落的相对丰度,影响因子与细菌种群夹角越接近0°代表两者呈正相关越显著,夹角越接近180°代表两者呈负相关越显著。由a图可以看出,土壤性质和化学成分与酶活性及细菌群落三者具有显著的相关关系,其中土壤铵态氮和溶解性有机碳与放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)及放线菌门(Actinobacteria)等显著正相关,而与土壤脲酶、浮霉菌门(Planctomycetes)及疣微菌门(Verrucomicrobia)等呈显著负相关,土壤全碳与土壤-β-葡萄糖苷酶及土壤过氧化氢酶呈负相关。b图显示,pH、速效钾、全磷及有效磷含量与嗜酸栖热菌属(Acidothermus)丰度呈显著负相关,与浮游菌属(Planctomyces)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)及土壤脲酶呈显著正相关,土壤硝态氮含量与中华单胞菌属(Sinomonas)、土壤-α-葡萄糖苷酶及土壤过氧化氢酶呈负相关,而与土壤-β-葡萄糖苷酶及伯克氏菌属(Burkholderia-Paraburkholderia)呈正相关,土壤全碳含量与外杆菌属(Exiguobacterium)呈正相关关系。

3 讨论

3.1 生物炭对土壤养分的影响

关于添加生物炭影响土壤理化性质的研究已经引起研究学者的广泛关注,本研究中添加生物炭改变了土壤化学性质,其中添加杉叶炭显著提高了土壤pH值、土壤全磷、有效磷、速效钾等的含量,添加木屑炭提高了土壤全碳含量,且随着添加量的增加而升高；由于1%生物炭添加量较低,所以引起的土壤养分的变化较高添加量不显著；与高温炭相比,低温炭对土壤DOC的提高较为显著；添加生物炭降低了土壤铵态氮的含量,而增加了硝态氮含量,说明硝态氮与铵态氮之间相互转化,其中杉叶炭降低更为显著,说明制备原材料和温度不同的生物炭对土壤性质的影响程度存在一定的差异。这一结果和Novak等[17]的的报道相似,他们研究发现添加生物炭能够有效提高土壤速效氮、磷、钾含量,Van等[18]认为生物炭的pH值大多呈碱性,灰分含量较高,可以降低土壤中交换性氢离子含量,从而添加生物炭能够提高土壤pH值,与本研究结果相似。不同的制备原料和热解温度对生物炭的性质具有很大的影响[19],通过对生物炭的物质含量测定可知,杉叶炭的pH、灰分含量、有效磷等明显高于木屑炭,因此添加杉叶炭对土壤pH值、全磷、有效磷、速效钾含量提高更显著,而木屑炭的碳含量更高,从而能够更显著提高土壤全碳含量。

图5 土壤性质与酶活性及细菌相对丰度相关分析Fig.5 Correlation analysis between soil propertiesand enzyme activity and relative abundance of bacteriaa图代表土壤性质与门分类水平上土壤细菌及酶活性的冗余分析,b图代表土壤性质与属分类水平上土壤细菌及酶活性的冗余分析,TP：全磷；AP：有效磷；AK：速效钾；硝态氮；铵态氮；DOC：可溶性有机碳；TC：全碳，TN：全氮；S-a-GC：土壤-α-葡萄糖苷酶；S-b-GC：土壤-β-葡萄糖苷酶；S-C：土壤过氧化氢酶；S-UE：土壤脲酶；Act：放线菌门Actinobacteria；Chlo：绿弯菌门 Chloroflexi；Pro：变形菌门 Proteobacteria；Firm：厚壁菌门 Firmicutes；Pla：浮霉菌门 lanctomycetes；Acido：酸杆菌门 Acidobacteria；Ver：疣微菌门 Verrucomicrobia；Sac：糖菌门 Saccharibacteria；Bact：拟杆菌门 Bacteroidetes；Pla：浮游菌属 Planctomyces；Sph：鞘脂单胞菌属 Sphingomonas；Kte：纤线杆菌属 Ktedonobacter；Exi：外杆菌属 Exiguobacterium；Aci：嗜酸栖热菌属 Acidothermus；Sin：中华单胞菌属 Sinomonas；Bur：伯克氏菌属 Burkholderia-Paraburkholderia

3.2 生物炭对土壤酶活性的影响

生物炭由于其自身独特的性质,添加后对土壤理化性质产生了一定的影响,并且在一定程度上也使得土壤酶活性发生了变化。添加生物炭整体促进了土壤-α-葡萄糖苷酶、土壤-β-葡萄糖苷酶及脲酶的活性,低添加量对葡萄糖苷酶的提高作用大于高添加量,高添加量对土壤脲酶的提高作用大于低添加量,而生物炭对土壤过氧化氢酶的影响不显著。Wang等[20]研究表明,低添加量的生物炭(质量分数为0.5%)可以提高参与C循环的土壤酶活性,高添加量的生物炭则降低其活性,而与N循环有关的土壤脲酶活性随着生物炭添加量的增加而提高,与本研究结果相印证。冯爱青等[21]表明在棕壤土中添加玉米秸秆生物炭能够提高土壤脲酶活性,却抑制了土壤过氧化氢酶活性,而本文中生物炭土壤过氧化氢酶的影响不显著。有研究发现,添加生物炭能够吸附植物根系土壤中反应底物,促进土壤酶活性；相反,添加生物炭也能够吸附土壤中的酶分子,对酶促反应结合位点形成保护作用,抑制土壤酶活性[22]。由于不同生物炭的组分和吸附具有特异性,不同土壤酶活性对添加生物炭的响应并非单一的促进或者抑制作用,土壤酶活性的改变程度主要受自身性质和生物炭性质及添加量的影响。

3.3 生物炭对土壤细菌群落结构及多样性的影响

添加生物炭对土壤细菌群落结构及多样性也具有一定的影响,添加杉叶炭能够提高土壤细菌丰度,而木屑炭对土壤细菌生长有一定的抑制作用,且添加低温炭的土壤细菌丰度大于高温炭,这与Liao等[23]研究结果一致,生物炭具有较大的比表面积和孔隙结构,为土壤细菌提供了有利的繁殖场所,并含有丰富C、N、P、K等营养物质,对土壤细菌的生长和相对丰度产生有利作用,也有研究发现添加有些生物炭抑制部分细菌的生长和繁殖,致群落多样性指数减小,有些木质原料制备的生物炭可利用性营养物质较低,氮素不足而不能支撑细菌生长代谢过程,从而降低细菌相对丰度[24],这些发现与本研究结果相似,添加杉叶炭对土壤营养物质的提高更显著,从而能够提高土壤细菌丰度和群落多样性,而木屑炭降低了土壤细菌丰度和群落多样性。Zhang等[25]通过添加300℃和700℃生物炭,发现土壤溶解性有机碳(DOC)在300℃生物炭处理时呈增加趋势,而700℃生物炭会降低DOC含量,因此印证了本文的实验结果,添加低温炭培养后土壤DOC含量大于高温炭,所以添加低温炭土壤细菌丰度大于高温炭。生物炭相对稳定,土壤细菌并不容易分解利用,从本文看出,由于生物炭本身的特性,添加生物炭后,直接对土壤pH,N、P、K等养分含量产生影响,可见生物炭是通过改变土壤性质间接影响土壤细菌群落结构及多样性。

3.4 生物炭处理土壤养分、酶活性及细菌丰度之间关系分析

土壤酶主要由土壤微生物、动植物及残体分泌,其中土壤微生物中的土壤细菌和放线菌等是土壤酶的主要来源,可见土壤酶活性与细菌存在直接相关关系[20],刘善江等[26]指出,酶是各种生化反应的催化剂,也是土壤细菌活性的表现,同时土壤微生物又是土壤酶的影响因素,印证本文结果,土壤细菌与酶活性有密切的联系。土壤细菌及放线菌产生大量的酶,其活力受到土壤物理状态和营养元素含量等的影响[17],从而土壤酶活性与土壤性质及养分有密切的关系。添加生物炭改变土壤pH值和营养元素含量,直接或间接影响土壤细菌群落结构及多样性,进一步影响了土壤酶活性。有研究证明,高pH值和灰分含量的生物炭施入土壤后,有机阴离子(—O—和—COO—)和无机碳酸盐增加,从而提高土壤pH值[18],本研究中杉叶炭本身具有更高的pH值和灰分含量,添加后比木屑炭提高土壤pH更显著；由于嗜酸栖热菌属(Acidothermus)是一种喜酸细菌,其相对丰度随着土壤pH的升高而降低,从而添加木屑炭使嗜酸栖热菌属丰度相对提高,而添加杉叶炭使嗜酸栖热菌属丰度降低；土壤疣微菌门(Verrucomicrobia)能够分泌一些与硝化作用有关的酶,促进硝态氮分解转化为铵态氮,故疣微菌与土壤铵态氮呈负相关而与硝态氮呈正相关；木屑炭中由于含有纤维素及复杂芳香物质较多而导致含碳量较高,放线菌分泌的胞外酶可以促进降解纤维素及复杂芳香物质,因此添加木屑炭能够提高土壤放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度；土壤细菌改变能够引起酶活性的变化,因此添加生物炭对土壤细菌群落结构及多样性和酶活性的影响呈显著的正负相关。但图中有些土壤酶与土壤养分及细菌群落关系不显著,这可能是因为土壤细菌种类繁多且作用方式有差异,或者该土壤酶的影响因素还有其他真菌或动植物。

4 结论

由于生物炭自身的性质和物质含量能够改变土壤pH值及全磷、有效磷、速效钾等养分含量,其中杉叶炭高于木屑炭,而添加木屑炭土壤全碳含量高于杉叶炭；生物炭能够促进土壤葡萄糖苷酶及脲酶的活性,其中低添加量提高程度更显著,对过氧化氢酶的影响不大,与N循环有关的土壤脲酶活性随着生物炭添加量的增加而提高；添加杉叶炭能够提高土壤细菌丰度,而木屑炭降低了土壤细菌丰度,添加低温炭土壤细菌丰度大于高温炭；添加生物炭对土壤pH值、全碳、全磷、有效磷、速效钾含量等具有直接影响,土壤组分和性质对不同细菌种群生活习性与功能产生不同的影响,细菌群落的变化又会引起土壤酶活性的改变,因此土壤养分含量、酶活性和细菌群落相对丰度具有密切的联系,对生物炭的添加存在规律性的响应。