LED光源照射对人皮肤成纤维细胞的影响

胡晓剑，陈泽庆，周小丽，刘木清

(1.复旦大学光源与照明工程系，上海 200433；2.先进照明技术教育部工程研究中心，上海 200433)

引言

光疗是利用光线的辐射能治疗疾病的一种理疗法。自人工光源被发明以来，光疗在医疗领域得到了相应的应用和发展。在各类疾病的治疗中，光疗主要作为辅助疗法，实现伤口愈合、杀菌治疗等作用[1-3]。光疗难以广泛应用的原因，一是人体内部的疾病难以引入光疗手段，二是由于在细胞生长的条件中光照并非必要条件，因此理论依据不足。皮肤作为人体面积最大的器官，长期暴露在光照环境下，皮肤细胞的生长会受到不同光照条件的影响。因此，研究光照对皮肤细胞的影响具有重要的意义。

过去的光疗通常采用激光光源，然而激光光源原理和结构较为复杂，成本较高，因此在使用上受到很多的限制[4, 5]。LED光源具有寿命长、结构简单、体积小、易控制等特点，与激光相比作为光疗应用的光源有着潜在的优势。本文通过实验研究了LED光源在不同条件下对人皮肤成纤维细胞的影响，为光疗在皮肤类疾病上的应用提供参考。

1 实验准备

1)人皮肤成纤维细胞。成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来，细胞活动旺盛，具备明显的蛋白质合成和分泌作用，在一定条件下可以实现与纤维细胞的互相转化，因此成纤维细胞对于不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损、创伤的修复具有重要的作用。人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮的主要组成部分，其可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，对于保持皮肤强度和弹性、修复损伤及美容美体具有重要作用，是维持皮肤年轻态的决定性因素，也是维持皮肤结构稳定的重要组成部分[6, 7]。

2)实验装置。相关研究表明，波长范围为380～780 nm的可见光对人皮肤成纤维细胞都有不同程度的影响[8-11]。本文在380～780 nm波长范围内选择5种典型波长LED作为照射光源，对培养在96孔细胞培养板中的人皮肤成纤维细胞进行照射，测定光照后的细胞活性，探究光照对人皮肤成纤维细胞的影响。通过设计以ZXLD1370驱动芯片为核心的LED驱动电路，采用14颗3 W大功率LED作为光源，在灯具表面配上光学透镜进行匀光，实现光强的均匀分布[12]。以ZXLD1370芯片为核心的LED驱动电路如图1所示。

图1 以ZXLD1370为核心的LED驱动电路示意图Fig.1 LED driver circuit based on ZXLD1370 driver

在ZXLD1370芯片的引脚中，V+与V-引脚用于接收外界的电源信号，为控制电路和发光电路提供电源。FB与SENSE引脚之间通过电子元器件构成一个内部电路，通过元器件的不同参数选择改变输出恒流的大小。LED+与LED-引脚用于连接LED发光电路使其发光。通过给ADJ施加信号，以线性调光方式输出稳态光。在实验前使用Thorlabs PM100D光功率计和S170C探头进行光功率密度的测量，将光功率密度设置为20 mW/cm2，实验用的5种LED使用远方SPIC-2000型号手持式照度计测定峰值波长，5种不同类型LED的峰值波长如表1所示。

表1 实验用LED的波长

由于细胞的培养过程中需要稳定的温湿度、CO2浓度和无菌的环境，因此细胞在培养过程中都是放置于细胞培养箱中生长的。细胞培养过程中同时施加以上的光照条件。

3)细胞培养。取液氮冻存中的人皮肤成纤维细胞，按细胞复苏的标准流程操作，于37 ℃温水中迅速解冻后，离心弃去上清液，加入含10%FBS，1%双抗的高糖DMEM培养基培养在25 cm2细胞培养瓶中，于5%CO2、37 ℃、95%相对湿度的细胞培养箱中培养，并日常观察细胞状态。待到显微镜下观察视野范围内细胞达到80%汇合程度时，即可进行传代培养。细胞传代培养时，使用0.25% Trypsin-EDTA将细胞从培养瓶中消化至脱落，转移到离心管中以1 000R的转速离心5 min，将离心后的细胞弃去上清液，使用含10%FBS，1%双抗的高糖DMEM培养基重悬，之后根据实验需求按细胞数目重新放置到25 cm2培养瓶中培养或是接种到96孔细胞培养板上准备实验[13, 14]。

4)主要设备。实验使用的主要设备包括兆信KXN-645D直流电源、飞逸FY2300-02M信号发生器、Thorlabs PM100D光功率计、Thorlabs S170C光功率探头、Olympus CKX53倒置显微镜、Heal Force AlphaClean 1300超净工作台、启前QQ-80A-II二氧化碳培养箱、瑞江RJ-TGL-1600R离心机、上海钻石803机械秒表、Thorlabs MultiScan酶标仪。

5)主要试剂。实验使用的主要试剂包括HyClone DMEM高糖培养基、Gibco FBS(乌拉圭来源)、HyClone PBS、Gibco 0.25% Trypsin-EDTA、Gibco Penicillin Streptomycin。

2 生长曲线实验

细胞的生长速度并不是固定的，而是随着培养条件、细胞数目、细胞状况等一系列条件发生变化。细胞的生长分为潜伏期、生长期、平台期和衰退期。其中潜伏期细胞生长缓慢，平台期细胞接近停止生长，衰退期细胞开始凋亡，而生长期的细胞生长状况旺盛，适合用于实验。因此在光照试验前，需要先测定细胞的生长曲线，确定细胞的生长期，以便于之后的实验选择生长期的细胞进行光照试验。

细胞的生长曲线一般有两种测定方法，一种是细胞计数法，另一种是CCK-8法。由于细胞计数法误差较大，因此一般用于简单观测生长趋势，我们采用更加精确的CCK-8法进行生长曲线测定[15]。

采用CCK-8法测定生长曲线时，将细胞以每孔1 000个的数量接种到96孔板中，共计接种54孔，并每孔补足0.1 mL培养基。除此之外，再选定6孔每孔加入0.1 mL不含细胞的培养基，作为对照。处理完成后，将96孔板放入细胞培养箱进行培养。24 h后取出96孔板，向其中6个孔加入1单位CCK-8试剂，充分混匀后重新放入培养箱培养1 h，之后取出并在酶标仪上读取位于450 nm处的吸光度值(optical density, OD)。以后每隔24 h取6个孔进行相同操作，可以获得8 d的细胞生长数据。实验过程中定期观察，及时补充新的培养基。实验所用的96孔板如图2所示，测得的数据如表2所示。

在数据处理时，为了减小误差，去掉一个最高和一个最低值，对数据进行处理得到相对细胞活性如表3所示。

图2 实验用96孔细胞培养板Fig.2 96-well cell culture plate used in experiments

表2 生长曲线实验每天样品的吸光度

表3 生长曲线实验中的相对细胞活性

根据数据作折线图得到细胞生长曲线，如图3所示。可以看出，人皮肤成纤维细胞在1～2天处于潜伏期，生长较为缓慢，从第3天开始生长速度明显加快，一直到第6天都能保持快速增长，而从第7天开始进入平台期，增长速度明显下降，在8天的测试中没有观测到明显的衰退期，推测衰退期应该在第9天及以后出现。因此可以总结出人皮肤成纤维细胞的生长期为3～6天，由此得出应取传代后3～6天的细胞进行光照实验。

图3 人皮肤成纤维细胞细胞生长曲线Fig.3 Cell curve of growth for human fibroblasts

3 光照实验

3.1 不同波长光照实验

取培养瓶中80%汇合的细胞进行接种操作，准备6个96孔板，每个六孔板接种6个孔，按照每孔1 000细胞的密度进行接种。其中A组在接种6孔细胞之后，再选6个孔，加入0.1 mL不含细胞的培养基，作为CCK-8测试的空白对照。将所有96孔板放入细胞培养箱中培养3 d后进行光照试验，各个实验组的光照条件如表4所示。

表4 不同波长光照实验设置的光照参数

表4中A为对照组，不进行光照，B～F为实验组，保持光照强度相同，时间相同，进行不同波长的光照。实验步骤如下：

1)调节培养箱参数使其达到适合细胞生长的温湿度和CO2浓度；

2)安装实验灯具，调节并测定光强，待灯亮10 min后再次测定光强，确保光强没有衰减；

3)放入96孔板进行光照，计时30 min；

4)取出96孔板，放入无光照培养箱中继续培养24 h；

5)取出96孔板，向实验孔中加入1个单位CCK-8试剂，混匀后放入培养箱中培养1 h；

6)使用酶标仪读取96孔板在450 nm处的OD值，并与对照组进行对照，得出细胞活性的数据。

3.2 不同时长光照实验

选择波长为630 nm的红光LED，探究光照时间对人皮肤成纤维细胞活性的影响。

取培养瓶中80%汇合的细胞进行接种操作，准备6个96孔板，每个六孔板接种6个孔，按照每孔1 000细胞的密度进行接种。其中A组在接种6孔细胞之后，再选6个孔，加入0.1 mL不含细胞的培养基，作为CCK-8测试的空白对照。将所有96孔板放入细胞培养箱中培养3 d后进行光照试验，各个实验组的光照条件如表5所示。

表5 不同时长光照实验设置的光照参数

表5中A为对照组，不进行光照，B～F为实验组，保持波长相同，光照强度相同，进行不同时间长度的光照。实验步骤如下：

1)调节培养箱参数使其达到适合细胞生长的温湿度和CO2浓度；

2)安装实验灯具，调节并测定光强，待灯亮10 min后再次测定光强，确保光强没有衰减；

3)放入96孔板进行光照，按照实验时间进行计时；

4)取出96孔板，放入无光照培养箱中继续培养24 h；

5)取出96孔板，向实验孔中加入1个单位CCK-8试剂，混匀后放入培养箱中培养1 h；

6)使用酶标仪读取96孔板在450 nm处的OD值，并与各实验组进行对比分析，得出细胞活性的数据。

4 实验数据及分析

4.1 实验数据

不同波长光照实验中，用酶标仪测得的数据如表6所示。

在不同时长光照实验中，用酶标仪测得的数据如表7所示。

表6 不同波长光照实验的样品吸光度

表7 不同时长光照实验的样品吸光度

4.2 数据处理及分析

实验中采用CCK-8法测定细胞的活性[16]。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的闭塞检测法。CCK-8利用了Dojindo开发的水溶性四唑盐—WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐), 它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料。WST-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。由于使用酶标仪检测，获得的数据为吸光度，计算公式为：

(1)

其中η为相对细胞活性，As为实验孔(含有实验组细胞，培养基，CCK-8)数据，Ac为对照孔(含有对照组细胞，培养基，CCK-8)数据,Ab为空白孔(含有无细胞培养基，CCK-8)数据。

实验中的所有数据均使用GraphPad Prism 7.0软件进行分析和作图。

4.2.1 不同波长对人皮肤成纤维细胞影响的分析

首先将酶标仪测得的吸光度数据按照计算公式转换为相对细胞活性的数据，在数据处理时，为了减小误差，去掉一个最高值和一个最低值，对数据进行处理得到相对细胞活性。处理后的数据如表8所示。

表8 不同波长光照实验的相对细胞活性

根据表格绘柱状图，x坐标为不同波长的实验组，其中Ctr表示无光照的对照组，y坐标为相对细胞活性，如图4所示。

图4 不同波长光照对细胞的影响Fig.4 Cell proliferation under different wavelength test

从图4中可以看出，不同波长的LED对人皮肤成纤维细胞具有不同影响。其中相对于无光照的对照组，在384 nm、418 nm、457 nm波长下细胞活性下降，其中384 nm波长下细胞活性下降最为明显，而457 nm波长对细胞活性的影响比较轻微。而526 nm、630 nm波长下细胞活性相对于无光的对照组增强，其中526 nm波长相对于无光对照组的细胞活性略有增强，而630 nm波长实验组的细胞活性增强更为明显。

不同的效果为我们的应用提供了多方位的选择。例如在选择去除增生组织的要求中，我们可以选择384 nm波长的LED光源，使多余的人皮肤成纤维细胞生长受到抑制；而在皱纹修复的要求中，我们可以选择630 nm波长的LED光源，使局部的人皮肤成纤维细胞活性增加，从而更快生长填满皮肤沟壑，达到修复的目的。

4.2.2 不同时长对人皮肤成纤维细胞影响的分析

首先将酶标仪测得的吸光度数据按照计算公式转换为相对细胞活性的数据，在数据处理时，为了减小误差，去掉一个最高和一个最低值，对数据进行处理得到相对细胞活性。处理后的数据如表9所示。

表9 不同时长光照实验的相对细胞活性

根据表9绘制折线图，x坐标为不同照射时长，其中对照组由于无光照，因此可以视为照射时长为0，y坐标为相对细胞活性，如图5所示。

图5 不同时长光照对细胞的影响Fig.5 Cell proliferation under different radiation length test

从图5可以看出，随着照射时长的增加，细胞活性变强，但细胞活性增强的趋势逐渐平缓。在光照时间小于30 min时，细胞活性随光照时间增加有较为明显的提升，而在光照时间超过30 min之后，细胞活性的水平趋于稳定。从实际治疗的角度来看，对一个患病部位进行过长时间的照射会导致病人的体验不佳，且无法获得更加显著的效果。因此本文认为，在光功率密度为20 mW/cm2的情况下，采取30 min的照射时长是比较合适的治疗方案。

5 结论

我们通过实验验证了LED对人皮肤成纤维细胞具有一定的影响，实验的数据表明，不同波长的LED照射人皮肤成纤维细胞会对细胞产生不同的影响，其中波长为384 nm、417 nm、457 nm会降低细胞活性，而波长526 nm、630 nm会提升细胞活性，即若要抑制细胞生长，应选择384 nm波长，若要促进细胞生长，则应选择630 nm波长。当选择促进细胞生长的630 nm波长进行实验时，可以从实验结果看出，照射时间越长，细胞活性的提升越大，在初步实验的参数设置中，可以看出在强度为20 mW/cm2的情况下，30 min的照射时间是较为适宜的。在后续的研究中，可以着重探讨的问题还有不同光强对于人皮肤成纤维细胞的影响等。本文的研究仅针对LED对体外培养的人皮肤成纤维细胞的影响得出初步结论，至于LED对人皮肤的影响效果是否与体外实验一致，还需进一步的研究。