盐酸多西环素对人工感染猪传染性胸膜肺炎的临床试验效果的研究

王德功，任丽花，刘 冬，李卓伟，张 沛，吕 让，杨国辉

（河北远征药业有限公司，河北省兽药工程技术研究中心，河北石家庄050041）

1 前言

猪传染性胸膜肺炎 （porcine infectious pleuropneumonia，PCP) 是一种具有高传染性的呼吸道疾病，以急性出血性和慢性纤维素坏死为特征。该病于1957 年首次报道，在世界各国家广泛流行， 是养猪业公认的世界性的细菌性疾病，同时该病与猪丹毒、 猪肺疫等病原易发生混合感染，致使该病一旦发生，发病率及死亡率明显升高，给养殖业带来重大损失。

2 试验材料与方法

2.1 试验动物、药品及菌株

2月龄、 体重10kg 左右的二元杂 （长白公猪×土母猪）仔猪54 头（雌雄各半），购自四川省名山县兴农养猪场。猪群健康，未曾接种猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗， 也无传染性胸膜肺炎感染史。猪群购入实验动物房圈舍适应性饲养7日后开展试验。

受试药物：10%盐酸多西环素预混剂，（以多西环素计）， 由河北远征药业有限公司提供。规格：5kg/袋；批号：090805。

对照药物：3%土霉素预混剂 （以土霉素计），由河北正大鸿福动物药业有限公司生产。规格：5kg/袋；批号：090623。

胸膜肺炎放线杆菌（App，编号为259），血清I 型，购自中国兽医药品监察所。

2.2 试验方法

2.2.1 疾病模型的建立 菌株启用与菌悬液制备：冻干菌种用适量无菌生理盐水溶解、混匀，恒温箱接种于TSA（胰胨大豆琼脂）培养基，置于5%CO2，37℃恒温箱中培养24h，对菌落进行染色观察， 并进行胸膜肺炎放线杆菌16S rRNA 基因PCR 鉴定。

挑取3-5 个鉴定确认并纯化的App 单菌落，于TSB（胰胨大豆肉汤）培养基上接种，在37℃恒温条件下培养12～16h；用平版计数法得到每1ml原菌液的菌落形成单位(CFU)。用无菌生理盐水稀释原菌液后进行染毒建立疾病模型。

染毒途径与染毒量：参考文献并预试，确定3.5～4.5×107 CFU/ml 的App 菌液， 按0.25ml/kg体重的染毒量， 采用一次性鼻腔喷雾法染毒，可获得症状明显、病变典型的放线杆菌胸膜肺炎疾病模型。

染毒：将新鲜制备并计数的App 原菌液用无菌生理盐水稀释成3.5～4.5×107 CFU/ml 的染毒菌液， 按0.25ml/kg 体重的染毒量给50 头试验猪进行一次性鼻腔喷雾法染毒；另外4 头试验猪给予相同剂量的无菌生理盐水。建立放线杆菌胸膜肺炎疾病模型。

2.2.2 试验分组

将染毒的50 头试验猪随机分成5 组， 每组10 头。其中I、II、III 组为试验组， 分别给予添加125ppm、250ppm 和500ppm（剂量以多西环素计）盐酸多西环素预混剂的饲料；IV 组为药物对照组，给予添加500ppm 土霉素的饲料；Ⅴ组为感染对照组， 给予不含任何药物的饲料；4 头未染毒（给予无菌生理盐水）的试验猪作为健康对照，给予不含任何药物的饲料。

2.2.3 给药和饲养管理 染毒6h 后开始给药。每天饲喂2 次（试验猪日粮用标准配制的仔猪全价日粮）， 每次添加饲料量以食后槽内有少量余料为准，自由饮水。连续饲喂7d，停药后观察7d。整个试验期间每日观察记录猪的临床表现；每日清扫圈舍，保持清洁干燥；每隔3d 对圈舍及周围用百毒杀喷雾消毒。

2.3 试验评价指标

2.3.1 临床症状 观察记录染毒后24h、 给药第7d、停药后第7d 各组病猪的临床症状，如食欲、精神状态、呼吸道症状、体温、排泄物等。根据相对应指标标准对各病猪进行评分（0—正常状态，1—轻度，2—中度，3—严重），计算各组内病猪的评分均值，比较组内和组间的差异显著性。

2.3.2 X 光诊断 染毒后12h， 各组随机选取1 头猪进行肺部X 光检查并拍片。

2.3.3 日增重及饲料转化率 称量并记录用药前（第0d）及停药后第7d 各组试验猪的体重，以及试验期间各组猪的耗料情况，计算各组猪的平均日增重和饲料转化率，并进行统计学分析。

2.3.4 病变观察与病原菌分离 停药后第7d，各试验组猪中随机选择5 头剖检，观察胸腔脏器的病变，按标准进行评分，得出组内评分均值，比较各组间的差异显著性。同时采集肺及胸腔积液进行病原菌检查。

胸腔脏器评分标准：①色泽正常，无明显的眼观病变（0 分）；②色泽基本正常，只有分散的、小面积的紫红色区域（1 分）；③有水肿、充血甚至分散出血，胸腔有少量的积液（2 分）；④有大面积的病灶，肺出现实变甚至粘连；胸腔有大量积液和纤维蛋白渗出物（3 分）。

2.4 疗效判定标准

1）治愈：连续给药7d 后，试验猪的食欲、精神、呼吸、体温恢复正常（症状评分=0），体重明显升高； 剖检时胸腔脏器没有特异性的病变 （评分≤1）；病料中无病原菌的检出。

治愈率= 组内治愈头数／组内给药头数×100%

2）有效：连续给药7d 后，试验猪的食欲、精神、呼吸、体温基本恢复正常（症状评分≤1 分），体重有所升高； 剖检时胸腔脏器病变的评分＜2分；病料中无病原菌的检出。

有效率=组内有效头数／组内给药猪头数×100%

3）无效：连续给药7d 后，试验猪的食欲、精神、呼吸、体温症状未见好转甚至恶化或死亡（症状评分＞1 分）； 剖检时胸腔脏器病变的评分≥2分；病料中有病原菌检出。

3 试验数据统计学处理

用SPSS 分析软件进行统计分析， 计量用±SD 表示，采用方差分析，其中死亡率、有效率、治愈率等使用卡方检验分析。

4 试验结果及分析

4.1 疾病模型建立结果

4.1.1 临床表现 试验猪染毒前精神、 食欲良好。鼻腔喷雾给予胸膜肺炎放线杆菌培养液4h 后，陆续出现短暂性呕吐、活动少、喜卧、呼吸急促、直肠温度升高（0.5～1.0℃）等临床症状；染毒12h后，50 头给予胸膜肺炎放线杆菌培养液的猪只都发病，表现为精神沉郁，摄食减少，呼吸困难，鼻腔内有泡沫样血性或脓性鼻液， 呼吸出现啰音、喉狭窄音，猪的体温大多升高1.0～2.5℃，部分猪只发生腹泻症状。攻毒后36～48h，感染对照组2头猪死亡。以相同方式给予无菌生理盐水的4 头猪未发病。

4.1.2 X 光诊断 染毒12h 后，各试验组猪中随机选取1 头检查肺部X 光。检查结果，健康猪的心、肺视野都无异常；染毒猪的肺部都会出现不同程度的炎症性病变。

4.1.3 剖检与病原菌分离 对死亡猪剖解时发现，胸腔内有大量的积液和纤维蛋白渗出物，肺部充血和出血严重，心包腔外附着有大量纤维蛋白渗出物，腹腔脏器没有明显眼观变化。无菌采集死亡猪的肺组织和胸腔积液用TSA 培养基进行分离培养并镜检，可获得革兰氏阴性小球杆菌；PCR检测分离菌株的16S rRNA 基因， 得到猪胸膜肺炎放线杆菌16S rRNA 基因片段。

4.2 药物疗效的结果

4.2.1 临床症状改善 试验过程中每日观察记录各组猪的临床症状，得出染毒后24h、给药第7d、停药后第7d 各组的症状评分均值， 分析比较组内各时间点和组间各时间点症状评分之间的差异，结果见表1。

表1 各组试验猪的症状评分结果

上述结果表明， 连续7d 混饲盐酸多西环素和土霉素，均可有效改善人工感染猪传染性胸膜肺炎的摄食减少、精神沉郁、体温升高、呼吸困难等症状。其中盐酸多西环素高剂量的作用效果最显著；中、低剂量的作用效果也较好，与土霉素相当。

4.2.2 日增重及饲料转化率 称量各组试验猪在给药前（给药第0d）和停药后第7d 的体重，记录试验期间各组猪的耗料情况，计算出平均日增重和饲料转化率（料肉比），结果见表2。

表2 试验期间各组猪的日增重及料肉比

上述结果表明，感染胸膜肺炎放线杆菌的病猪连续7d 混饲盐酸多西环素和土霉素， 均能提高病猪的日增重和饲料转化率 （料肉比）。其中中、高剂量盐酸多西环素的效果为最佳，二者无显著差异，均显著优于土霉素。低剂量盐酸多西环素的效果与土霉素接近。

4.2.3 病变愈合与病原菌消除 停药后第7d，各试验组猪中随机选择5 头剖检，观察胸腔脏器病变并按标准评分，得出组内评分均值，比较各组的差异显著性；同时采集各猪的肺组织及胸腔积液进行病原菌检查。结果见表3。

上述结果表明， 病猪连续7d 混饲盐酸多西环素和土霉素，可有效清除感染猪体内胸膜肺炎放线杆菌，并可促进病猪体内胸腔脏器病变的好转和痊愈。高、中、低剂量组的盐酸多西环素的上述作用都比土霉素效果好，且高剂量盐酸多西环素的效果略优于低、中剂量，但低、中剂量之间无显著差异。

4.2.4 有效率及治愈率 综合停药7d 后各组试验猪的临床症状改善和恢复、日增重和饲料转化率、胸腔病变和病原菌检出的情况，按标准进行试验疗效判定，可得到各试验组猪的有效率和治愈率，结果见表4。

表3 停药后第7d 部分病猪胸腔脏器病变评分及病原菌检出情况（n=5）

表4 停药7d 后各试验组猪的有效率和治愈率

上述结果表明， 连续7d 混饲盐酸多西环素和土霉素，对感染猪传染性胸膜肺炎的病猪均有良好治疗效果。其中盐酸多西环素的中、高剂量组的有效率均为100%，治愈率90%以上；低剂量盐酸多西环素和土霉素的有效率均为100%，治愈率80%。盐酸多西环素的中、高剂量组对猪传染性胸膜肺炎的治疗效果相当，均优于盐酸多西环素低剂量组和土霉素组。

5 结论

该盐酸多西环素制剂预混剂对人工感染猪放线杆菌传染性胸膜肺炎有良好治疗效果。低（125ppm）、中（250ppm）、高（500ppm）剂量组均可有效清除感染猪体内的胸膜肺炎放线杆菌，并可促进病猪体内胸腔脏器病变的好转和痊愈，显著改善病猪的临床症状，并能提高给药猪的日增重和饲料转化率，因此，盐酸多西环素预混剂对猪传染性胸膜肺炎具有治疗作用。

考虑到盐酸多西环素中 （250ppm）、高（500ppm）剂量的治疗效果无明显差异，均优于低剂量（125ppm），故临床使用该盐酸多西环素预混剂治疗猪传染性胸膜肺炎时，推荐剂量为中剂量（250ppm），即每吨饲料添加10%盐酸多西环素预混剂2.5kg，连用7日。