马驽巴贝斯虫Bc48蛋白的纯化及其应用

宋晶晶，王盼举，许正茂，艾日登才次克，王莉君，吾力江，张梦圆，巴音查汗

（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆自治区动物卫生监督所，乌鲁木齐830011）

马驽巴贝斯虫病是马驽巴贝斯虫（Babesia caballi）经媒介蜱传播寄生于马属动物（马、驴、斑马等）红细胞内引起的一种血液原虫病。传播媒介为森林革蜱、草原革蜱和银盾革蜱等硬蜱[1]，呈急性、亚急性、慢性发病，临床症状分心肺型和肠胃型，主要表现为发热、贫血、黄疸、水肿、肝肿大、血管内溶血，血红蛋白尿甚至是死亡等症状。马驽巴贝斯虫病是能影响全世界马产业经济的重要疾病之一，分布于热带和亚热带地区及温带地区[2-3]。马驽巴贝斯虫感染动物死亡率高，生产力低，管制措施成本高，并且可影响国际马匹贸易和流动，从而造成极大的经济损失。我国将其列为马二类疫病，OIE（世界动物卫生组织）将其列为B类疫病[4-6]。

马驽巴贝斯虫病临床诊断通常采用血涂片染色方法来观察红细胞的染虫情况。由于马驽巴贝斯虫在马属动物感染潜伏期长且呈慢性感染（带虫期），血涂片染色方法应用于临床大批量检测需耗费较大的财力、人力。虽然补体结合实验、间接免疫荧光抗体实验和酶联免疫吸附实验（ELISA）均可有效检测阳性样品，但是补体结合实验和间接免疫荧光抗体实验假阳性率高、敏感性低[6]。在对于急性或慢性及大批量检测努巴贝斯虫感染情况时，rELISA是目前最合适的检测方法，该方法具有成本低、特异性强、灵敏度高、制备简单等优点[7-8]。本研究以纯化重组Bc48蛋白作为包被抗原的ELISA对新疆地区马努巴贝斯虫病进行检测，加大新疆地区该病的流行病学调查研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准血清、菌种和质粒E.coli表达菌BL21感受态细胞、构建成功的马驽巴贝斯虫Bc48基因原核表达质粒pGEX4T-1-Bc48、马驽巴贝斯虫病阳性血清、阴性血清均由新疆农业大学动物医学学院寄生虫实验室保存、提供。

1.1.2 血清样本来源 采自新疆南疆巴音郭楞蒙古自治州和硕县（40份），阿克苏地区（11份），北疆阿勒泰地区富蕴县（29份），伊犁地区昭苏县洪纳海乡（21份），昭苏县种马场（111份）伊犁卡拉苏（24份）共256份马匹血样，常规方法分离血清，-20℃保存、备用。

1.1.3 主要试剂 IPTG、氨苄霉素（Amp+）、吐温（Tween） 均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；TMB显色液购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白Marker 购自北京全式金生物有限公司；ELISA酶标板购自NUNC公司；鼠抗马IgG-HRP购自BETHYL公司；氯化钠、酵母浸粉、胰蛋白胨、氢氧化钠、氯化钾等均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 Bc48重组进行蛋白的制备 将原核表达质粒pGEX4T-1-Bc48转化至BL21感受态，将鉴定为阳性的菌落进行扩大培养，诱导表达后，采用KCl染色切胶纯化Bc48蛋白[8]，纯化后用BCA法进行蛋白浓度的测定。

1.2.2 ELISA检测 用PBS将切胶纯化后的目的蛋白稀释为最适工作浓度0.8 μg/mL，采用碳酸盐包被酶标板，按照每孔100 μL加至反应板中，4℃过夜。 每孔加入200 μL PBST（0.5%吐温）清洗5次，甩掉液体拍干后，每孔加入3%的脱脂乳（200 μL），37℃下封闭2 h。

将封闭好的反应板洗涤5次，拍干。待检血清用封闭液50倍稀释后加至反应板，每个样品重复3个反应孔，每孔100 μL，37℃孵育1 h，同时加入阴性、阳性标准血清作为对照。将反应板洗涤5次甩净液体后拍干，加入10 000倍稀释后的二抗，每孔100 μL，37℃孵育1h。洗涤反应板后，每孔加入100 μL TMB显色液，37℃作用15 min后，每孔加入100 μL 2mol/L H2SO4终止反应，在酶标仪450 nm处进行读数。血清样本OD450≤0.221时，判定为阴性；OD450值＞0.221时，判定为阳性[9]。

2 结果

2.1 Bc48重组蛋白诱导及纯化结果电泳结果显示，37℃、终浓度为0.4 mmol/L的IPTG诱导4 h可成功表达出分子量约36 kDa目的蛋白，且Bc48重组蛋白以包涵体的形式存在（图1）。利用0.25 mol/L的KCl染色切胶纯化方法获得大量高纯度的目的蛋白（图2）。SDS-PAGE结果显示纯化效果较好，经BCA法测定浓度为360 μg/mL。

图1 Bc48重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of Bc48 recombinant proteins

图2 Bc48重组蛋白的纯化结果Fig.2 Purification result of Bc48 recombinant protein

2.2 南北疆疫区马驽巴贝斯虫病 rELISA样品检测结果采用rELISA法对新疆南北地区256份血清进行马驽巴贝斯虫抗体检测，结果显示，南疆和硕、阿克苏地区马驽巴贝斯虫阳性率分别为30%（12/40）、9%（1/11）；北疆伊犁种马场、洪纳海乡、卡拉苏和阿勒泰富蕴、阿尕什敖包乡地区阳性感染率分别为17%（19/111）、17%（4/21）、12.5%（3/24）、5%（1/20）、35%（10/29），阿勒泰富蕴县感染率最高。

3 讨论

马驽巴贝斯虫病现为OIE指定检测马属动物寄生虫病之一，患病马匹往往通过媒介蜱传播且呈常年携带状态[5-6]。新疆驽巴贝斯虫病发病率及死亡率较高[10]，因此相关检测技术的研究显得尤为重要。马驽巴贝斯虫呈常年携带状态，并且对于临床症状不明显的马匹，临床诊断或血液涂片检查都难以确诊，“带虫马”的漏诊可造成传染源被忽略。

马驽巴贝斯虫二温式、荧光PCR检测方法已被报道[11]，虽然具有更高的特异性及灵敏度，但对于基层大量样品的检测及硬件条件设备等需求较高。本研究通过原核表达系统及KCl染色纯化的Bc48重组蛋白作为rELISA基础包被抗原，具有较强的特异性，阳性符合率达到95%，这与前期多次临床经验应用密切相关[12-14]，可以更好的实时监测马驽巴贝斯虫病的感染情况。根据相关文献报道[12-14]，在伊犁、阿勒泰、塔城及巴州等地区，马驽巴贝斯虫病感染率较高，但此次调查结果显示北疆伊犁，阿勒泰地区的感染率有所降低，可能是近两年科技宣传和驱虫方法比较到位。

表1 新疆部分马驽巴贝斯虫病血清学调查结果Table 1 Serological investigation of Babesia caballi infection in Xinjiang

也有报道指出，马驽巴贝斯虫作为蜱传播的病原体也是马驽巴贝斯虫病的致病因子，能够不同程度的感染马属动物，造成直接或间接经济损失[15-16]。因此，疫区实时监测马驽巴贝斯抗体情况显得尤为重要，可为研究人员评估相关的危险因素及驱虫药/疫苗的使用提供依据。地方人员也应在媒介硬蜱活动季节采取一定的预防和控制措施，制定和改进防控措施，降低马匹疫病带来的经济影响。