盘尾丝虫ASP1蛋白佐剂活性区不同标签融合表达与佐剂活性比较

胡 威，卢会鹏，张晓凯，李洋洋，张鑫宇，夏晓莉，孙怀昌,2

（1.扬州大学兽医学院 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院，泰州225300）

重组亚单位疫苗安全性好，但免疫原性较差，需与适当免疫佐剂配合使用才能取得良好免疫效果。现有免疫佐剂主要有油佐剂和水佐剂，其中油佐剂诱导抗体产生较慢，应激反应较大，但抗体维持时间较长；水佐剂诱导抗体产生快，应激反应较小，但抗体维持时间较短。这些传统免疫佐剂一般只能增强体液免疫应答[1]，因此迫切需要研制能诱导全面免疫应答的新型免疫佐剂。

盘尾丝虫（Onchocerca volvulus，Ov）第三期幼虫活化相关分泌蛋白（activation-associated secreted protein 1，ASP-1）具有很强的免疫佐剂活性[2-3]。将重组Ov-ASP-1与卵清蛋白、人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）或SARS冠状病毒重组亚单位疫苗进行动物免疫试验，结果显示不仅能促进平衡的Th1/Th2抗体应答，而且能增强向Th1偏移的细胞免疫应答[4]。将重组Ov-ASP-1与低剂量流感病毒灭活疫苗免疫小鼠，不仅能显著加强和加速抗体应答，还能加强交叉免疫保护[5]。将Ov-ASP-1的PR-1佐剂活性区与卵清蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、HIV抗原肽免疫小鼠，不仅能刺激抗原特异抗体产生，而且能刺激脾细胞产生γ干扰素和IL-6等细胞因子[6]。然而这些重组大肠杆菌表达的Ov-ASP-1均为不溶性包涵体，不仅需要进行复杂的变性/复性处理，而且需使用价格较贵的亲和层析柱进行纯化，作为兽用免疫佐剂使用时受到很大限制。

类弹性蛋白多肽（elastin-like polypeptide，ELP）是根据体内弹性蛋白五肽重复序列（如VPGXG）合成的多肽聚合物，具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度下呈可溶状态，在高于相变温度下呈凝聚状态，因此其融合蛋白可通过简单的相变循环纯化[7-8]。同时，ELP也具有一定的免疫佐剂作用[9]。ELK16等自聚肽能在细菌内或液体中自动聚集成蛋白凝聚物，其融合蛋白可用离心洗涤法纯化，纯化效率与亲和层析法接近[10]。本研究将Ov-ASP-1佐剂活性区PR-1分别与ELP、ELK16和His标签进行融合表达，与传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）重组VP2蛋白进行动物免疫试验，旨在探索不同纯化标签对PR-1免疫佐剂活性的影响，同时为IBDV新型亚单位疫苗佐剂研制提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料ELK16自聚肽和ELP融合表达载体pETP16P[10]和pET-ELP[8]由本实验室构建和保存；His标签蛋白纯化试剂盒购自康为世纪公司；烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）蛋白酶活性包涵体由本实验室制备[11]；RPMI 1640细胞培养液购自美国GE公司；细胞因子ELISA试剂盒购自武汉酶免生物公司；SPF级Balb/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。

1.2 重组载体构建用网上在线软件JAVA Codon Adaption Tool，将IBDV VP2基因片段[12]优化成大肠杆菌偏爱密码子序列，5'端引入TEV蛋白酶切位点，序列由上海生工生物公司合成。用限制酶SalI和XhoI将VP2编码序列插入pET-ELP载体，重组载体命名为ELP-VP2。将上海生工生物公司合成的ASP-1的PR-1功能区[6]编码序列分别插入pET-P16P、pETELP和pET-30a载体的SalI/NotI位点，获得的重组载体命名为pELK-PR1、pELP-PR1和pET-PR1。

1.3 重组蛋白表达分别将重组质粒pELP-VP2、pELK-PR1、pELP-PR1和pET-PR1转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞，37℃振荡培养过夜。按1∶100比例接种500 mL卡那霉素（50 μg/mL）2×YT培养基，37℃振荡培养至OD600=0.6，加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG，37℃诱导表达6 h。4℃、

4000 ×g离心10 min，收集菌体，用1/10体积菌体裂解液或PBS重悬，然后用JNBIO高压细胞破碎仪破碎3次（1300 pa），4℃、12 000 ×g离心10 min，收集上清。加入终浓度为0.5%聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）混匀，4℃、14 000 ×g离心10 min，离心收集上清用于重组蛋白纯化。

1.4 重组蛋白纯化ELP融合蛋白的相变循环按文献[8] 进行，纯化ELP-VP2融合蛋白的相变温度为26℃，氯化钠浓度为1.5 mol/L；纯化ELP-PR1融合蛋白的相变温度为26℃，用0.4 mol/L硫酸铵和1 mol/L尿素进行。孵育10 min后，室温、12 000 ×g离心5 min，沉淀用预冷PBS重悬，冰浴30 min，4℃、12 000 ×g离心10 min去除不溶性杂蛋白，必要时重复1次相变循环。ELK-PR1融合蛋白纯化按文献[10-11] 进行，将高压破碎菌液在4℃、12 000 ×g离心10 min，沉淀蛋白先用洗涤液1（50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/LNaCl、2 mol/L尿素、1% Triton X-100、1 mmol/LEDTA、3 mmol/LDTT, pH 8.0）离心洗涤2次（4℃、1000 ×g离心10 min），再用洗涤液2（50 mmol/LTris-HCl、50 mmol/L NaCl、0.5% Triton X-100, pH 7.2）离心洗涤3次，最后用1%Triton X-114抽提去除内毒素，PBS离心洗涤2次后备用。His-PR1融合蛋白的纯化按照康为世纪His标签蛋白纯化试剂盒说明书进行。

1.5 ELP标签切除ELP-VP2融合蛋白标签切除按文献[11] 进行，沉淀的融合蛋白先用预冷TEV蛋白酶反应液4℃复溶，按1∶30 μg比例与TEV蛋白酶活性包涵体混合，30℃孵育6 h；4℃、12 000 ×g离心10 min，去除蛋白酶活性包涵体，上清液加入2 mol/L氯化钠在26℃条件下再次相变循环，离心去除ELP蛋白沉淀，上清液用PBS透析1次。

1.6 小鼠免疫将20只6周龄Balb/c小鼠随机分为5组，每组4只，分别为VP2、VP2+IFA（不完全弗氏佐剂）、VP2+ ELP-PR1、VP2+ELK-PR1和VP2+His-PR1免疫组，免疫途径为腿部肌肉注射，抗原用量为20μg/只，所用3种PR-1融合蛋白摩尔浓度相同，His-PR1用量为10μg/只，ELP-PR1用量为26.6 μg/只，ELK-PR1用量为12.4μg/只，首免后2周加强免疫1次。首免后每周眶下静脉丛采血分离血清，-80℃冻存备用。

1.7 免疫小鼠抗体检测免疫小鼠血清的VP2特异IgG、IgG1和IgG2c用间接ELISA检测，包被抗原为纯化VP2重组蛋白（5 μg/mL），4℃包被过夜，PBST（含0.1%Tween-20的PBS，pH7.4）洗板3次；封闭液为含5%脱脂乳粉的PBST，37℃封闭1 h；PBST洗板3次，各孔依次加入连续倍比稀释（从1∶100开始）的免疫小鼠血清，37℃作用1 h；PBST洗板3次，加入酶标羊抗鼠IgG、IgG1或IgG2c，37℃作用1 h；PBST洗板3次，每孔加入100 μL显色液，室温避光显色20 min，加入50 μL终止液终止反应。以空白孔调零，用全波长酶标仪测定每孔OD450值，将P/N ≥ 2.1判为阳性，P/N ＜ 1.5判为阴性。

1.8 免疫小鼠细胞因子检测初免后28 d采血分离血清，按照细胞因子检测ELISA试剂盒说明书测定免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10浓度，每个样品设3次重复，计算平均值（x）及标准误（s）。

2 结果

2.1 重组VP2蛋白表达与纯化将ELP-VP2重组载体转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞，用0.2 mmol/L IPTG在37℃条件下诱导6 h。SDS-PAGE分析显示表达的ELP-VP2融合蛋白为66.6 kDa，与预期相符，经过2次相变循环纯化的融合蛋白纯度为95%；用TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签，再次相变循环回收的重组VP2蛋白为预期的13 kDa，纯度为95%（图1）。

2.2 PR-1融合蛋白的表达与纯化分别将His-PR1、ELK-PR1和ELP-PR1融合表达载体转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞，用0.2 mmol/L IPTG在37℃诱导6 h，SDS-PAGE分析显示表达的His-PR1、ELK-PR1、ELP-PR1融合蛋白分别为预期的23、28、60 kDa（图2）。其中，His-PR1融合蛋白为不溶性包涵体表达，在变性条件下用镍亲和柱纯化；ELK-PR1融合蛋白为活性包涵体表达，用离心洗涤法纯化；ELP-PR1融合蛋白为可溶性表达，用相变循环纯化（表1）。

图1 ELP-VP2融合蛋白表达、纯化与标签切除Fig.1 Expression, purification and tag cleavage of ELPVP2 fusion protein

表1 三种PR-1融合蛋白的纯化指标Table 1 Purification performance of three PR-1 fusion proteins

2.3 免疫小鼠抗体水平检测在初次免疫后第1周和第4周，对5个实验组小鼠采血分离血清，以重组VP2蛋白为检测抗原，用间接ELISA检测抗原特异性IgG、IgG1和IgG2c。在初免后d7，His-PR1佐剂组总IgG水平与VP2免疫对照组差异具有显著统计学意义（P＜0.05），IFA、ELK-PR1和ELP+PR1佐剂组差异具有极显著统计学意义（P＜0.01），其中ELP+PR1佐剂组总IgG水平最高；His-PR1和IFA佐剂组的IgG1水平与VP2免疫对照组差异不具有显著统计学意义，ELP-PR1佐剂组差异具有显著统计学意义，ELK-PR1佐剂组差异具有极显著统计学意义；4个佐剂组的IgG2c水平与VP2免疫对照组差异具有极显著统计学意义，其中ELP-PR1佐剂组的IgG2c水平最高（图3）。在初免后28 d，4个佐剂组的总IgG水平与VP2免疫对照组差异具有极显著统计学意义，其中ELP-PR1佐剂组总IgG水平最高；His-PR1佐剂组的IgG1水平与VP2免疫对照组差异具有显著统计学意义，其他3个佐剂组差异具有极显著统计学意义；4个佐剂组的IgG2c水平与VP2免疫对照组差异具有极显著统计学意义，其中ELP-PR1佐剂组IgG2c水平最高（图4）。

图2 三个PR-1融合蛋白的表达及纯化Fig.2 Expression and purification of thee PR-1 fusion proteins

2.4 小鼠血清细胞因子检测在初免后28 d采血分离血清，用ELISA试剂盒检测细胞因子浓度。与VP2免疫组对照相比，ELP-PR1佐剂组的IFN-γ水平差异具有极显著统计学意义，其他3个佐剂组差异不具备显著统计学意义（图5A）；与VP2免疫对照组相比，ELK-PR1佐剂组的IL-6水平差异具备显著统计学意义，ELP-PR1佐剂组差异具有极显著统计学意义，ELK-PR1和His-PR1佐剂组差异不具备显著统计学意义（图5B）；与VP2免疫对照组相比，ELP-PR1免疫组的IL-10水平差异具有极显著统计学意义，其他3个佐剂组差异具备显著统计学意义（图5C）；与VP2免疫对照组相比，IFA佐剂组的TNF-α水平差异不具备显著统计学意义，其他3个佐剂组差异具有极显著统计学意义（图5D）。

图3 免疫小鼠的VP2特异抗体检测（初免后d7）Fig. 3 Detection of VP2-specific antibody response in mice on day 7 after immunization

图4 免疫小鼠的VP2特异抗体检测（初免后d28）Fig. 4 Detection of VP2-specific antibody response in mice on day 28 after immunization

3 讨论

重组蛋白和合成肽等亚单位疫苗安全性较好，但免疫原性较差，需与适当佐剂配合使用。铝盐和油乳剂等传统免疫佐剂可以加强疫苗抗原的体液免疫应答，但不能形成有效的细胞免疫。Toll样受体（toll-like receptor，TLR）等模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）可以激活抗原提呈细胞和促炎性细胞因子产生，在先天性和获得性免疫应答中发挥重要作用，因此TLR是一种具有很大应用前景的新型免疫佐剂[13]。Ov-ASP-1是TLR2和TLR4的配体，具有很强的免疫佐剂活性，活性区位于核心致病性相关-1（PR-1）结构域[6]。重组大肠杆菌表达的PR-1不仅对卵清蛋白和乙肝表面抗原等具有体液免疫增强作用，还能诱导细胞免疫应答[6]，但其表达产物需用镍亲和柱纯化，成本较高，难以规模化制备，在兽医临床使用中受到限制。ELP是根据体内弹性蛋白重复序列合成的多聚体，具有免疫原低、体内相容性好等优点，已作为药物传送载体和组织工程材料被研究人员进行开发。更为重要的是，ELP具有温度敏感的可逆相变特性，其融合蛋白可用简单的相变循环纯化，是近年来快速发展的重组蛋白纯化标签[8]。本研究中，ELP-PR1融合蛋白纯化可以在2.5 h内完成，纯化蛋白的纯度高达93%，与镍亲和层析纯化His-PR1融合蛋白的效率（95%）接近。亲和层析纯化His-PR1融合蛋白的回收率和产量高于ELP-PR1融合蛋白，但需用价格较贵的镍亲和层析柱，而且纯化过程需时长达21 h，而ELP-PR1融合蛋白的纯化仅需氯化钠等常规化学试剂和离心机等简单设备。ELK16等自聚肽能自动聚集成活性包涵体，因此其融合蛋白也可用简单的离心洗涤法纯化[10-11]，这在本研究中得到进一步验证。

图5 免疫小鼠血清细胞因子检测Fig.5 Detection of cytokines in immunized mouse serum

自然环境中IBDV广泛存在，疫苗使用非常普遍，所以难以找到适合免疫应答研究的非免疫雏鸡或鸡胚，即使是非免疫雏鸡或鸡胚也不能保证无IBDV母源抗体存在。SPF雏鸡不仅来源受限、价格较贵，试验过程中也容易受到IBDV污染而导致试验失败。小鼠为IBDV非易感动物，SPF小鼠不仅来源方便，试验过程中也不会受到IBDV污染。因此，本研究分别将3种PR-1融合蛋白与IBDV重组VP2抗原进行小鼠免疫试验，以便对重组VP2抗原的免疫原性及其所需免疫佐剂进行初步评价。

初免后7 d，3个PR-1佐剂组VP2特异IgG滴度较VP2免疫对照组均有显著提高，其中ELP-PR1佐剂组升高最显著，ELK-PR1佐剂组与IFA佐剂组相当，His-PR1佐剂组较差。在初免后28 d，3个PR-1佐剂组VP2特异IgG滴度均进一步升高，但抗体水平变化相似。除抗原特异性IgG1滴度不同程度升高外，3个PR-1佐剂组的IgG2c水平也有显著升高，进一步证明Ov-ASP-1的PR-1结构域不仅能诱导平衡的Th1/Th2应答，还能将免疫应答向Th1偏移。在3个融合标签中，ELP不仅分子量最大（55 kDa），还能在体内形成颗粒样结构，可能是ELP-PR1佐剂活性较强的原因所在。His标签分子量最小（0.5 kDa），加之PR-1分子量也较小（16 kDa），His-PR1免疫佐剂活性较低可能与其降解速度较快有关。

细胞因子包括Th1和Th2类细胞因子，前者代表性细胞因子主要包括IL-6、IFN-γ和TNF-α，主要参与细胞免疫调节；后者代表性细胞因子主要有IL-4和IL-10，主要参与体液免疫调节[14]。在3个PR-1佐剂组中，ELP-PR1对IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α四种细胞因子产生的刺激作用均较强，可能与其自身免疫佐剂活性有关。ELK-PR1 对IL-6、IL-10和TNF-α产生的刺激作用较强，而His-PR1对IL-10和TNF-α产生的刺激作用较强。研究结果不仅证明PR-1能刺激Th1和Th2细胞因子产生，而且提示不同融合标签对PR-1刺激产生的细胞因子种类可以产生影响。