饮用水检测中抗生素类标准物质稳定性研究

陈永艳 吕佳 邢方潇 张岚,* 卢晓华 金宁

(1 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京 100050；2 中国计量科学研究院，北京 100029 )

自1940年青霉素应用于临床至今，抗生素已达几千种，广泛应用于医疗、畜牧业。关于环境水体及饮用水中抗生素的来源、分布水平、检测分析方法及水体中抗生素对健康的影响已有了较多的综合分析，目前抗生素检测方法多为液相色谱串联质谱法[1-3]，可实现环境水体中抗生素残留量测定。由于环境水体中抗生素含量较低，通常需要将水样运回实验室后立即或储存一段时间后经过固相萃取等前处理后再进行检测分析。目前实验室常用的储存方法包括冷藏或样品提取富集后冷藏，有关保存后水样中抗生素的稳定性却鲜有报道。本实验室先期在全国范围内开展饮用水中抗生素等潜在污染物调查与监测工作[4-6]，根据不同流域抗生素的污染种类和污染水平均有所不同，通过对检出频率、污染水平的比较，最终选取5种磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类抗生素进行稳定性研究，其中磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑为磺胺类；氟甲喹、噁喹酸为喹诺酮类；苯唑西林为β-内酰胺类抗生素，这也与文献[7-9]报道的磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类抗生素在环境水体中污染状况相吻合。因此开展这些抗生素标准物质的稳定性研究，使抗生素标准物质量值准确可靠，对保证样品测定时达到准确定量具有十分重要的意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱联用仪(XEVO Micro TQS)(美国Waters公司)，配有电喷雾离子源(ESI)；超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；涡流振荡器(美国Talboys公司)；感量0.0001g电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；0.22μm聚醚砜滤膜(上海安谱实验科技股份有限公司)。

甲醇(HPLC-MS级，美国Fisher公司)；甲酸(LCMS级，美国Fisher公司)；高纯氮气、氩气；实验用水为超纯水。标准物质：磺胺二甲嘧啶(99.50%，美国Chemservice公司)；磺胺甲噁唑(99.50%，美国Chemservice公司)；氟甲喹(99.30%，美国Sigma公司)；噁喹酸(99.50%，美国Chemservice公司)；苯唑西林(99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2 实验条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm, 1.8μm)，柱温：40℃。进样体积：10μL。流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：甲醇，流速：0.35 mL/min。洗脱程序见表1。

1.2.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离(ESI)，正离子扫描，多反应监测(MRM)模式分析，源温度120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂气流量650L/Hr，碰撞气流量50L/Hr，毛细管电压2.0kV。多反应监测(MRM)条件见表2。

1.3 实验方法

1.3.1 方案

本实验根据先期在全国范围内开展的饮用水中抗生素等潜在污染物调查与监测工作，选取生活饮用水中检出率较高、具有代表性的5种不同类别的抗生素标准物质，使用超高效液相色谱串联质谱法检测并定量。对不同浓度标准物质溶液分别4℃冷藏保存及20℃常温保存，观察其稳定性情况，直至量值变化10%以上的时间点，并在该时间点终止实验；在饮用水空白水样中添加一定浓度的抗生素标准物质，将样品分别4℃冷藏保存及20℃常温保存，观察其稳定性情况。

要求每组涉及前、中、后最少3个时间点，每个时间点不少于2个独立重复测试数据。

1.3.2 考察样溶液配制

(1)分别准确称取磺胺甲噁唑、氟甲喹、噁喹酸、磺胺二甲嘧啶、苯唑西林标准物质1.0mg，用甲醇将其溶解定容至100mL容量瓶中，即得浓度为10mg/L的混合标准储备溶液。

(2)准确移取“(1)”中混合标准储备液10～100mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀。该标准溶液浓度为1000μg/L，将其分装至两个棕色标准溶液储液瓶中，常温(20℃)储存、4℃储存，备用。每次上机测定前，将该标准溶液用甲醇稀释50倍后上机测定；

表1 5种抗生素测定时的洗脱梯度Tab.1 Gradient elution program for the analysis of the 5 antibiotics

表2 5种抗生素的相关质谱参数Tab.2 MS parameters of the 5 antibiotics

(3)准确移取“(1)”中混合标准储备液0.10～100mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀。该标准溶液浓度为10μg/L，将其分装至两个棕色标准溶液储液瓶中，常温(20℃)储存、4℃储存，备用。每次上机直接测定。

(4)准确移取“(1)”中混合标准储备液0.50～500mL容量瓶中，用空白自来水样品定容，混匀。该样品中标准物质浓度为20μg/L，将其分装至两个棕色玻璃螺口试剂瓶中，常温(20℃)储存、4℃储存，备用。样品每次上机前经0.22μm滤膜过滤后直接测定。

2 结果

2.1 方法检出限、定量限

以目标分析物色谱峰信噪比S/N=3和S/N=10计算对应的质量浓度作为检出限和定量限，详见表3。

表3 5种抗生素的检出限、定量限Tab.3 Limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of the 5 antibiotics

2.2 结果分析

本研究对饮用水检测中抗生素的稳定性情况进行研究，其中包含其在饮用水样品溶液中的稳定性以及标准物质在甲醇溶液中的稳定性。标准物质配制通常使用甲醇溶液，样品前处理中固相萃取试剂通常使用甲醇，因此选取不同溶剂对抗生素稳定性影响时，考察水和甲醇两种溶剂。

2.2.1 不同的溶剂对抗生素稳定性影响不同

分别对10和1000μg/L标准物质甲醇溶液，以及加标量为20μg/L的实际样品进行不同保存温度下的量值稳定性评估。本研究涉及的5种典型抗生素，在甲醇溶液体系内磺胺甲噁唑、氟甲喹、噁喹酸、磺胺二甲嘧啶、苯唑西林标准物质均在2d内降解率达到22.1%以上，详见表4～7。在水样样品基质中，除苯唑西林外，其他几种抗生素7d内均未发生显著降解，详见表8～9。苯唑西林虽然降解显著，但在同等储存温度条件下水溶液中抗生素降解速率低于甲醇溶液。

2.2.2 温度变化对抗生素稳定性的影响程度不同

本研究涉及的5种典型抗生素，部分抗生素稳定性受储存温度影响较为明显。苯唑西林受储存温度影响最大，如图1所示。苯唑西林1000μg/L标准溶液在20℃常温储存1d后降解率高达28.5%，而其冷藏储存降解率仅为2.2%，10μg/L标准溶液在常温储存1d后降解率高达96.2%，而其冷藏储存降解率为20.2%。20μg/L样品溶液在20℃常温储存2d后降解率高达77.92%，而其冷藏储存降解率为15.42%，7d后降解率为88.85%，而其冷藏储存降解率为28.46%。

表4 10μg/L抗生素标准物质在4℃避光储存稳定性情况Tab.4 The stability of antibiotic standard substances (10μg/L, stored in dark at 4℃)

表5 10μg/L抗生素标准物质在 20℃避光储存稳定性情况Tab.5 The stability of antibiotic standard substances (10μg/L, stored in dark at 20℃)

表6 1000μg/L抗生素标准物质在4℃避光储存稳定性情况Tab.6 The stability of antibiotic standard substances (1000μg/L, stored in dark at 4℃)

表7 1000μg/L抗生素标准物质在 20℃避光储存稳定性情况Tab.7 The stability of antibiotic standard substances (1000μg/L, stored in dark at 20℃)

表8 自来水样品加标20μg/L在4℃避光储存稳定性情况Tab.8 The stability of the tap water sample spiked with 20μg/L standard (stored in dark at 4℃)

表9 自来水样品20μg/L 20℃避光储存稳定性情况Tab.9 The stability of the tap water sample spiked with 20μg/L standard (stored in dark at 20℃)

图1 苯唑西林在甲醇溶液中的稳定性Fig.1 The stability of oxacillin in methanol solution

部分抗生素稳定性受储存温度影响不明显，磺胺甲噁唑、氟甲喹、噁喹酸、磺胺二甲嘧啶在自来水样品中，常温保存或冷藏保存，均未发生显著降解，而在甲醇溶液中，虽然在一定程度上降解，但受保存温度影响不大，如图2～5所示。

磺胺甲噁唑10μg/L标准溶液在冷藏和常温储存1d后降解率分别为16.8%和12.4%，1000μg/L标准储备液在冷藏和常温储存1d后降解率均小于10%，2d后降解率分别为26.2%和27.4%。

图2 磺胺甲噁唑在甲醇溶液中的稳定性Fig.2 The stability of sulfamethoxazole in methanol solution

图3 氟甲喹在甲醇溶液中的稳定性Fig.3 The stability of flumequine in methanol solution

图4 噁喹酸在甲醇溶液中的稳定性Fig.4 The stability of oxolinic acid in methanol solution

图5 磺胺二甲嘧啶在甲醇溶液中的稳定性Fig.5 The stability of sulfamethazine in methanol solution

氟甲喹10μg/L标准溶液在冷藏和常温储存1d后降解率均小于0.5%，2d后降解率分别为36.3%和35.5%；1000μg/L标准储备液在冷藏和常温储存1d后降解率均小于10%，2d后降解率分别为43.6%和40.7%。

噁喹酸10μg/L标准溶液在冷藏和常温储存1d后降解率均小于5%，2d后降解率分别为22.1%和22.7%；1000μg/L标准储备液在冷藏和常温储存1d后降解率小于等于10%，2d后降解率分别为26.6%和27.2%。

磺胺二甲嘧啶10μg/L标准溶液在冷藏和常温储存1d后降解率分别为10.0%和11.2%，2d后降解率分别为58.1%和56.2%，1000μg/L标准储备液在冷藏和常温储存1d后降解率均小于10%，2d后降解率分别为38.4%和40.1%。

3 结论

通过对饮用水检测中5种抗生素稳定性的研究可以发现，抗生素的稳定性与其溶解的溶剂有关，在水溶液中稳定性优于甲醇溶液；部分抗生素稳定性与储存温度有关，如低温储存显著延缓苯唑西林素降解。因此，测定饮用水中抗生素时，样品采集后尽快测定，尽量缩短样品前处理时间，有利于检测结果的准确性。

抗生素标准物质溶液若不能实现现配现用，也应当注意储备液有效期。在饮用水检测中对样品及标准物质建立良好的储存和使用条件, 避免和减少抗生素的降解，对加强抗生素检测过程中的质量控制、提高检测结果准确性具有重要参考价值。