重组UK114融合蛋白的表达纯化及免疫组化定位

尹淑琴，范艳，朱宏，梁娟，常泓

(1.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 期刊社，山西 太谷 030801)

UK114(山羊肝脏肿瘤抗原)是钙蛋白酶系统中经典钙蛋白酶之一CAPN1/S1(μ-calpain)的激活蛋白[1]。钙蛋白酶系统是广泛存在于生物体中的依赖Ca2+调节的蛋白水解酶系统，目前发现的钙蛋白酶已有17种[2,3]。它是导致动物宰后蛋白质水解的主要酶系统，在宰后完整肌原纤维的崩解中发挥作用，可以促进肉嫩化的水解[4,5]。国外许多研究表明，UK114和ACBP分别是CAPN1/S1和CAPN2/S1的正调节因子[6,7]。

UK114蛋白作为钙蛋白酶ⅠCAPN1/S1的激活蛋白，还有许多生物学特性,它参与肿瘤生长的抑制、介导细胞溶解和细胞生长的调节等生理生化过程[8,9]。UK114蛋白同时还与具有分子伴侣特性的HSP90的结构类似[10]。本研究首先运用大肠杆菌BL21(DE3)表达重组UK114蛋白，并对其进行纯化和酶切，进而制备兔抗UK114多克隆抗体，用间接ELISA法测定效价，Western blot分析纯化后的蛋白，最后运用免疫组织化学法分析UK114蛋白在组织中的分布情况。本研究旨在为进一步研究UK114蛋白与钙蛋白酶的作用机理以及UK114的其他生物学特性如参与肿瘤细胞的生物调节机制等方面提供一定的蛋白试验依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

E.coliBL21(DE23)菌株购自TaKaRa公司；重组质粒pGEX-4T-3-UK114由山西农业大学生命科学学院分子生物学实验室提供。试验制备抗体所用的成年雄性新西兰白兔购自山西医科大学实验动物中心。GST琼脂糖凝胶FF、苯甲脒琼脂糖凝胶FF购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司；PV rabbit 二步法免疫组化试剂盒和浓缩型DAB试剂盒购自天津灏洋生物制品科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 GST-UK114蛋白在大肠杆菌中的诱导表达、纯化及酶切方法

将重组质粒pGEX-4T-UK114转入E.coliBL21(DE23)感受态细胞悬液中，IPTG的终浓度为0.3 mmol·L-1、诱导温度为28 ℃、诱导时间为6 h，对重组UK114蛋白诱导表达。

将诱导表达好的融合蛋白采用GST琼脂糖凝胶FF预装柱纯化，蛋白含量的测定根据考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定。根据试剂盒提供公式计算蛋白含量。

GST-UK114蛋白酶切反应应条件：50 μL1 mg·mL-1融合蛋白溶液(在酶切缓冲液中)及1 U·μL-1凝血酶0.5 μL；25 ℃下温浴反应：在2 h、4 h、6 h、8h、10 h和16 h等时刻从反应1中分别取出5 μL反应液与2 μL 5×SDS上样缓冲液混匀；将所有样品煮沸5 min，加样于SDS-PAGE凝胶上分析样品的稳定性以及裂解的效率。纯化的蛋白产物用SDS-PAGE检测。

1.2.2 抗UK114蛋白抗体的制备及纯化

抗原准备及免疫动物：选用两只体重2 kg左右的健康雄性新西兰白兔供免疫用。免疫用抗原为纯化的UK114蛋白，蛋白含量为1 mg·mL-1。弗氏完全佐剂抗原：弗氏完全佐剂2 ml，抗原2 ml；弗氏不完全佐剂抗原：弗氏不完全佐剂2 ml，抗原2 ml。上述佐剂抗原均在免疫前配制，并充分混合乳化。采用间接ELISA法检测抗体效价，抗体纯化采用辛酸硫酸铵沉淀法。抗体SDS-PAGE电泳检测并进行Western blot免疫印迹分析。

1.2.3 UK114蛋白免疫组织化学检测

制备山羊肝脏和肾脏组织切片，HE染色，采用PV robbit二步法检测试剂盒做免疫组织化学检测。

2 结果与分析

2.1 GST-UK114蛋白在大肠杆菌中的诱导表达纯化

2.1.1 GST-UK114融合蛋白的纯化

重组质粒pGEX-4T-3-UK114转化大肠杆菌BL21。按最适诱导条件诱导表达，离心收集菌体，超声法裂解，将处理后的菌体上清上样于装有Glutathione Sephrose 4B的亲和层析柱，用含还原型谷胱甘肽的洗脱缓冲液洗脱，洗脱峰出现在5～15 ml和25～30 ml(见图1)，收集洗脱峰，成功纯化出GST-UK114融合蛋白(见图2)。由图2 SDS-PAGE电泳结果可以看出，重组菌经诱导后的细菌全蛋白在相对分子量约40kD处有一条明显条带。该蛋白泳带的位置与推测的融合蛋白的分子量40kD(UK114 14kD+GST 26kD)一致。纯化的融合蛋白根据公式计算其融合蛋白的含量为1.45 mg·mL-1。

图1 亲和层析洗脱图Fig.1 GST affinity chromatograpy

图2 GST-UK114亲和层析纯化后SDS-PAGE分析结果Fig.2 SDS-PAGE analysis of GST-UK114 after affinity Lane M.Low Weight Protein Marker；L1.GST-UK114 before affinity resin；L2.GST-UK114 after affinity resin

2.1.2 GST-UK114融合蛋白的酶切及酶切UK114蛋白的纯化

凝血酶与融合蛋白的用量比为10 U·mg-1，25 ℃的条件下进行酶切，酶切时间分别为2 h、4 h、6 h、8h、10 h和16 h，以GST-UK114融合蛋白和对照，酶切完成后SDS-PAGE凝胶电泳检测。(见图3)如图所示，随着酶切时间的延长，酶切效果越来越明显，酶切16小时大部分融合蛋白已经酶切完成，酶切16小时是最佳酶切时间。把酶切后溶液上样于Glutathione Sephrose 4B的亲和层析柱，用于吸附GST蛋白和部分未酶切的GST-UK114融合蛋白，分离得到UK114蛋白。再通过苯甲脒亲和层析柱，除去凝血酶，从而得到目标蛋白UK114(见图4)。结果表明，GST-UK114融合蛋白酶切后出现四个条带，从上到下分别是目的蛋白UK114、凝血酶、GST蛋白和部分未酶切的GST-UK114融合蛋白，经过GST琼脂糖亲和层析柱，除去了GST蛋白和部分未酶切的GST-UK114融合蛋白，只有两个条带：目的蛋白UK114和凝血酶。然后通过苯甲脒亲和层析柱，除去凝血酶。最终得到目标蛋白UK114。电泳结果显示目标蛋白的分子量为14kD，与预期UK114蛋白的分子量大小相符，并且纯度很高。用超滤离心管浓缩后，用1 ml PBS缓冲液置换原蛋白的缓冲液体系，然后经考马斯亮蓝法测定蛋白含量，根据公式计算其融合蛋白的含量为0.72 mg·mL-1。

图3 不同酶切时间对GST-UK114融合蛋白的影响Fig.3 SDS-PAGE analysis of GST-UK114 digestion Lane M.Low Weight Protein Marker;L1.Purified GST-UK114;L2.GST-UK114 digestion without Thromibin;L3-8.Thromibin digestion 2、4、6、8、10、16hours

2.2 兔抗UK114多克隆抗体的制备及检测

2.2.1 动物免疫及抗体检测

试验家兔经过最后一次加强免疫一周后，耳静脉采血，分离血清，用间接ELISA法测定效价。结果显示，两只被免疫的家兔血清效价均大于1∶125 000，其中2号家兔的抗体效价达到1∶625 000。表明通过1次免疫和3次加强免疫得到了理想的高效价兔抗UK114多克隆抗血清(见表1，图5)。

表1 间接ELISA法测定抗血清效价Table 1 Indirect ELISA analysis antiserum titer

图5 间接ELISA法测定抗血清效价Fig.5 Indirect ELISA analysis antiserum titer

2.2.2 抗体纯化

兔抗UK114多克隆抗血清用醋酸缓冲液稀释，缓慢加入辛酸，离心收集上清，然后用硫酸铵沉淀IgG，最后透析除盐，得到纯化的兔抗UK114多克隆抗体(见图6)。

由图6可以看出，兔抗UK114多克隆抗体主要是由IgG组成，纯化前的血清中明显有许多杂带，而纯化后杂带基本消失，SDS-PAGE电泳图上IgG的重链和轻链条带比较清晰，可见用辛酸硫酸铵沉淀法，得到了比较纯的抗UK114多克隆抗体。纯化后的抗体经考马斯亮蓝法测定蛋白含量，根据公式计算其融合蛋白的含量为0.53 mg·mL-1。

抗体经过纯化后，用间接ELISA法检测抗体效价。与纯化前相比，效价虽然有所下降，但两只家兔的抗体效价均大于1∶25000。

2.3 重组UK114蛋白免疫印迹(Western blot)分析

以制备的兔抗UK114多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG为二抗进行免疫印迹分析(见图7)。结果表明，诱导表达的GST-UK114融合蛋白在约40kD处有一明显条带，而诱导前样本无带显现。纯化后的GST-UK114融合蛋白在约40kD处有一明显条带。融合蛋白酶切后在14kD附近出现一条带，成功酶切出UK114蛋白，且酶切完全。

图6 抗体纯化的SDS-PAGE分析结果Fig.6 SDS-PAGE analysis of antibody after purification Lane M.Low Weight Protein Marker；L1.Rabbit 1 antiserum；L2.Purified IgG from Rabbit 1;L3.Rabbit 2 antiserum;L4.Purified IgG from Rabbit 2

图7 Western blot分析GST-UK114及酶切产物Fig.7 Western blot analysis GST-UK114 and Purified UK114 L1.E.coli BL21 contain pGEX-4T-UK114 after induced by IPTG;L2.E.coli BL21 contain pGEX-4T-UK114 before induced by IPTG;L3.Purified GST-UK114;L4.Purified UK114

2.4 重组UK114蛋白在山羊肝脏和肾脏中的免疫组织化学定位

据文献报道，UK114蛋白主要分部于肝脏和肾脏组织。采用兔抗UK114蛋白抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG为二抗，按照二步法免疫组化检测试剂盒使用说明书的步骤进行操作，DAB显色，在光学显微镜下观察结果(见图8)。阴性对照未见特异性着色(图8-A，8-C)，肝脏组织中肝小叶边缘区有肝细胞出现棕色的阳性着色，部分肝窦内皮细胞也有棕色的阳性着色(图8中箭头所指)，说明制备的抗UK114多克隆抗体可以与正常山羊肝脏和肾脏组织中的UK114蛋白结合。由山羊肝脏免疫组化试验结果(图8-B)可以看出，免疫组化染色主要发生在细胞质中。山羊肾脏免疫组化试验结果(图8-D)显示，免疫组化染色主要发生在细胞质中。肾脏皮质中的肾小管上皮细胞有棕色的阳性着色出现(图中箭头所指)，肾小球中没有出现着色。

图8 免疫组织化学检测山羊UK114蛋白(DAB，×200)Fig.8 Immunohistochemistry analysis of UK114(DAB，×200)A.山羊肝脏对照；B.山羊肝脏免疫组织化学染色；C.山羊肾脏对照；D.山羊肾脏免疫组织化学染色A.The control group of goat liver;B.The experiment group of goat liver;C.The control group of goat kidney;D.The experiment group of goat kidney

3 讨论与结论

UK114是钙蛋白酶CAPN1/S1的激活蛋白，在钙蛋白酶的蛋白水解过程中发挥作用。Yanfu He等在研究钙蛋白酶在宰后对鱼肉的潜在影响中发现UK114可以通过降低钙蛋白酶激活所需Ca2+来发挥作用[11]。而钙蛋白酶系统不仅参与宰后肉嫩化过程中內源蛋白的水解过程，同时还参与的其他疾病病理过程：如糖尿病、阿尔兹海默氏病、神经元退变及细胞信号转导等生理生化反应[12,13]。Thomas等研究发现UK114为Rid蛋白家族的成员之一。Rid蛋白家族参与细胞体内氨基酸代谢途径，影响氨基酸代谢的生物合成[6,14]。已有报道大多集中在UK114蛋白的结构与功能方面，对其在组织中的具体存在状态机及分布情况了解不多，本研究采用免疫组织化学分析了UK114蛋白在组织中的分布情况，为进一步研究UK114的生理生化功能提供一定的理论依据。

由于试验所采用的组织为肝脏和肾脏，它们都含有丰富的生物素，如果应用亲和素试剂染色，内源性生物素易于亲和素结合，形成亲和素(或链亲合素)-生物素复合物，导致假阳性发生[15]。所以实验采用了非生物素二步法免疫组织化学检测试剂盒，由于它不使用生物素，因此可以有效地避免由于内源生物素所造成的背景染色。此外由于试验采用石蜡切片，在标本固定的时候，抗原之间会发生桥连。固定的时间越长，所形成的桥连就越紧密，这导致了许多抗原决定簇被封闭。这时就需要加热使抗原之间的桥连水解，激活抗原。试验采用了微波炉修复法[16]，从试验结果来看，效果比较明显。

本试验应用分子手段获得重组UK114蛋白，并对其进行纯化分析、免疫组化定位，对于后续的分子伴侣特性以及抗肿瘤特性的研究提供一定的蛋白试验依据，也可以为肿瘤的治疗和细胞的生物调节机制等研究开辟出一条新的途径。