类志贺邻单胞菌的检测方法概述

陈美群，扎西拉姆，潘瑛子

(西藏自治区农牧科学院水产科学研究所,西藏 拉萨 850032)

类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides))是一种革兰氏阴性、氧化酶阳性的运动性杆菌，隶属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)邻单胞菌属(PlesiomonasHabs and Schubert,1962)内唯一的一个种[1]。该菌是一种全球性分布细菌，池塘、淡水，地表水等水体是其主要生活环境，而水生动物尤其鱼类是其主要宿主[2-12]。同时，该菌是一种人-兽共患病原菌[13]，被认为是通过水和食物传播的胃肠道感染暴发的病原体[14-15]，该菌可引起急性肠胃炎、腹泻等症状，还可以引起脑膜炎、败血症、蜂窝组织炎、肺炎等肠外感染症状[16-24]，为此受到国内外学者的广泛关注。引起鱼类患病的致病菌种类繁多，而且有些患病鱼类发病的相似症状是由不同病原菌引起的，此外同种致病性类志贺邻单胞菌在不同鱼种中发病的症状也会有差异，加之类志贺邻单胞菌引起鱼类发病愈加频繁，往往由于不能及时鉴定病原菌而延误治疗，不仅给水产养殖业造成了重大经济损失，而且也给消费者带来了一定的健康安全隐患。为此快速、准确的鉴别出病原菌，并有针对性的选择对症药物进行防治显得尤为重要。目前，对类志贺邻单胞菌的常用检测诊断方法主要分为以下三大类。

1 传统检测技术

1.1 选择性培养基法

Miller[25]和Levin[26]比较了2种固体培养基(PL和IBB)对水生样品中类志贺邻单胞菌的分离和恢复效果，研究发现在竞争微生物水平较低的样品或已受到低温、高温等损伤的样品中，使用PL培养基回收类志贺邻单胞菌效果较好；而对于杂菌高度污染的样品，使用IBB培养基对类志贺邻单胞菌的回收率会更高。Freund 等[27]对5种不同的富集方法(革兰氏阴性肉汤、碱性蛋白胨水、无碘四硫酸盐肉汤和两种单胞菌肉汤)与淡水样品直接涂布法进行了比较，结果表明四硫酸盐肉汤对类志贺邻单胞菌的回收率明显高于其他四种肉汤(P<0.05)，且也明显高于直接涂布法，建议在常规检测类志贺邻单胞菌时，在直接涂布前使用四硫酸盐肉汤在40 ℃进行富集培养。Huq等[28]比较了3种培养基(PDA、IBB、MSS)在不同温度下对类志贺邻单胞菌和气单胞菌属细菌的分离效果，研究发现有气单胞菌存在的情况下，选择PDA培养基于44 ℃孵育24 h后类志贺邻单胞菌分离效果较好。由于类志贺邻单胞菌与气单胞菌具有一些共同的特性，并且此二菌在一些肠道培养基上的菌落形态相似，难以区别，为了筛选出一种制作简单，便于观察，可提高类志贺邻单胞菌分离率及准确率的培养基，李槿年[29]比较了类志贺邻单胞菌和嗜水气单胞菌在5种不同培养基上的生长情况及菌落特性，发现改良去氧胆酸钠琼脂(改良DC)分离效果最好。为了提高类志贺邻单胞菌的检出率，王素秋等[30]选择了几种常用的增菌液和4种选择性分离用培养基，对该菌的检出效果进行了比较，结果表明使用双倍碱性胨水和氯化锶胨水两次增菌后，再用改良DC平板分离效果最佳，比常规检测法的检出率提高了几十倍，具有显著性意义。

表1 类志贺邻单胞菌的部分选择性分离培养基

1.2 生理生化鉴定技术

传统生理生化鉴定技术是依据《伯杰氏细菌系统分类学手册》或《常见细菌系统学鉴定手册》等，结合形态及一些生理生化反应特征来对细菌进行鉴定[31]。传统生理生化鉴定技术结果准确、可信度较高，但是检测项目多、耗时长，不利于细菌性疾病的快速诊断与防治。为此，一些依赖于全部或部分测定生化反应指标的编码鉴定法以及自动化鉴定系统被逐渐开发出来。李槿年[32]采用国产革兰氏阴性杆菌编码鉴定系列培养基对28 株分离自安徽省内养殖场发病鱼、鳖、蟹等水产动物体内的致病细菌进行鉴定，结果显示2株细菌未能得到鉴定外，其余26株细菌均可鉴定到属或种水平，可鉴定率为92.86 %，该编码鉴定法比传统生理生化鉴定法操作更为简便、快速(24～48 h)和准确，同时又克服了自动化鉴定系统需要昂贵仪器的缺点，因此具有较高的实用价值。根据相关报道，目前主要应用API细菌鉴定系统[33]、ID32E微量多项试验鉴定系统[34]、BD PhoenixTM-100 全自动细菌鉴定/药敏系统[35]、ATB 细菌鉴定仪[36]、GYZ-15eV 生化检测试剂盒和BIOLOG 自动微生物鉴定系统[37]等自动化鉴定系统对类志贺邻单胞菌进行生化鉴定，自动化鉴定系统具有快捷、准确、灵敏、高效等优点，但自动化鉴定仪价格昂贵，一般基层单位难以推广应用。

2 免疫学诊断技术

免疫学诊断技术主要是通过利用抗原抗体间的特异性反应而开发的一系列病原检测技术，由于该技术具有特异性强、灵敏度高、可快速检测病原等特点，在鱼类疾病诊断中得到广泛应用。张新艳[38]研究制备了兔抗类志贺邻单胞菌血清，效价为1∶1.28×105，并建立了间接ELISA(酶联免疫吸附实验)检测方法，检测灵敏度为1.0×104CFU·mL-1，制备的多克隆抗体具有良好的检测特异性，与其它弧菌科水产常见病原菌均无交叉反应，可用于特异性检测类志贺邻单胞菌，为该菌的快速检测和疾病的早期诊断与治疗提供了研究基础。

3 分子生物学检测技术

分子生物学技术是通过鉴定病原核酸来确认病原体，该方法具有快速、准确、灵敏度高等优点，而传统的细菌鉴定方法费时费力，试验结果稳定性和重复性较差，因此分子生物学检测技术可以起到很好的补充作用。随着DNA提取技术的完善、PCR技术的日益成熟以及各种分子探针标记的发展，由此建立起的以聚合酶链式反应技术(PCR技术)、核酸杂交技术、序列对比技术及荧光定量PCR技术等为代表的多种分子生物学检测方法的应用越发广泛。

DNA酶和蛋白酶会降低DNA的扩增水平，据有关报道甲醛能破坏组织样本中的DNA酶和蛋白酶[39-42]。在PCR反应中添加牛血清白蛋白(BSA)可提高PCR反应产物的扩增[43-44]，BSA和DNA纯化均略有降低PCR抑制，但是，每个PCR反应中添加的BSA的量应该优化。 Levin等[45]研究了不同的处理方法(添加甲醛、添加BSA和DNA纯化)对PCR定量检测蛤蚌和牡蛎中类志贺邻单胞菌的影响，研究表明在未富集的蛤蚌组织中检测到类志贺邻单胞菌的水平为200 CFU/g，而在PCR反应或DNA纯化体系中加入0.1 %牛血清白蛋白(BSA)，检测水平降低到60 CFU/g；未富集的牡蛎组织样本对PCR反应有明显抑制作用，类志贺邻单胞菌的检测水平为6×105CFU/g，在牡蛎组织匀浆中加入4.0 %甲醛后，大大降低了PCR抑制，检测水平下降到6×102CFU/g；DNA纯化或BSA均略微提高了PCR的灵敏度，检测水平下降到2×105CFU/g；甲醛+ BSA、甲醛+ DNA纯化、甲醛+ BSA + DNA纯化处理组合，牡蛎组织中类志贺邻单胞菌的检测水平均为2×102CFU/g。Levin等[46]又研究了通过甲醛处理牡蛎组织匀浆、差速离心和包埋有荧光假单胞菌的活性炭处理样品去除PCR抑制剂的创新方法，用于实时PCR定量检测牡蛎中类志贺邻单胞菌，结果表明甲醛或涂层炭处理牡蛎组织样品均可显著降低PCR抑制，先用甲醛处理样品，再用覆膜炭处理牡蛎样品，可进一步降低了PCR抑制，使每克样品的最低检测水平为1×103个基因组目标，相当于每RT-PCR检测水平为25个基因组目标。

Gonzalez-Rey等[47]研究发现类志贺邻单胞菌23S rRNA基因(C-906, G-1189)具有较高的变异性，针对该区域设计得两条引物能够区分类志贺邻单胞菌和变形杆菌、弧菌、气单胞菌等在基因上密切相关的细菌种类，利用该引物对水生环境、动物和人类腹泻病例中的类志贺邻单胞菌进行特异性检测效果较好。张新艳等[48]通过比对已知类志贺邻单胞菌与弧菌属、气单胞菌属的23S rRNA序列，设计了类志贺邻单胞菌特异引物PS23F(5’-CTCCGAATACCGTAGAGTGCTATCC-3’)，PS23R(5’-CTCCCCTAGCCCAATAACACCTAAA-3’)，对类志贺邻单胞菌和弧菌科水产常见致病菌进行特异性扩增，只有类志贺邻单胞菌扩增结果为阳性、其他菌株扩增结果均为阴性。Herrera等[49]针对类志贺邻单胞菌 hugA 基因设计了一组特异性引物，研究表明该特异性引物扩增片段长度435 bp，对鱼肉中类志贺邻单胞菌检测效果较好。孟双等[50-51]以类志贺邻单胞菌hugA基因为靶点，设计了环介导的等温扩增(LAMP)方法，该方法可快速、特异、灵敏地检测类志贺邻单胞菌，对33株非类志贺邻单胞菌菌株均未检出，同时该方法的灵敏度比普通聚合酶链反应高100倍，是一种快速、灵敏的类志贺邻单胞菌检测方法。

荧光定量PCR是通过荧光标记的特异性探针或荧光染料，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。孟双等[52]于2011年将荧光探针运用到类志贺邻单胞菌的检测，根据类志贺邻单胞菌特异性较高的23S rRNA基因5’端序列设计了TaqMan探针，建立了类志贺邻单胞菌实时荧光TaqMan PCR快速检测方法，该方法对类志贺邻单胞菌基因组的检测灵敏度为3×10-2pg/反应体系，该检测体系在检测30 种其他肠道致病菌时均未产生特异性扩增，该实时荧光TaqMan PCR检测体系具有灵敏度高、特异性好、快速等优点。陈智瑾等[53]采用高灵敏度、低PCR抑制性的EVAGreen染料代替传统的SYBR Green I荧光染料，通过采用自制的选择性增菌液(煌绿肌醇胆盐肉汤)对样品进行短时间前增菌处理后，大大提高了检测灵敏度(达到25 cfu/10 mL)，该方法具有快速、高灵敏度和高特异性以及可应用于复杂样品的优点。严寒秋等[54]对31株经传统生化鉴定为类志贺邻单胞菌的菌株，利用特异性引物和探针对这31株菌株的23S rRNA基因进行荧光定量PCR检测，结果经荧光定量PCR检测只有28株为类志贺邻单胞菌，研究表明通过生化鉴定和荧光定量PCR分子水平鉴定两者的有机结合，不仅能提高类志贺邻单胞菌鉴定的准确性，还能提高其检出率。

4 小 结

由于病原菌种类繁多，形态结构(如有无荚膜和鞭毛)和生理生化特性(如产酸产气等特性)变化较大，因此难以建立一套能针对所有病原菌的检测方法。普遍做法是在分离纯化出病原菌之后，首先对其进行生理生化特征鉴定，随后再根据之前的结果进行微生物系统和分子生物学检测，综合各项结果才能给出比较信服的结论。笔者于2017年从在西藏拉萨国家农业科技园区水产养殖基地(水温12 ℃)人工驯养的患病异齿裂腹鱼中也分离到类志贺邻单胞菌。目前对从鱼源类志贺邻单胞菌致病机理的研究较少，但近年来由该菌引起的养殖鱼类患病愈加频繁[55]，给消费者带来了重大的安全隐患，因此在今后有必要在患病鱼类中快速准确鉴定出致病性类志贺邻单胞菌的基础上，还要深入开展该菌致病机理等方面的后续研究，这对明确该菌对鱼类的致病性并控制其传播具有重要意义。在水产养殖中，目前抗生素经常被用来控制微生物性传染病，但抗生素长期大量反复使用，容易造成微生物产生耐药性[56]。笔者从西藏土著鱼中还分离出Micrococcussp.、Microbacteriumsp.、Penicilliumsp.、Exiguobacteriumsp.、Arthrobactersp.、Rhizopussp.、Leptosphaeriasp.、Microsphaeropsissp.、Acremoniumsp.等益生菌[57]，计划后期开展这些菌株对类志贺邻单胞菌的拮抗作用，提取上述分离微生物的次级代谢产物并开展其抑菌活性分析，以期找到对类志贺邻单胞菌具有较好抑制作用的新型活性物质，为传统鱼类抗生素药物的替代及该菌的防治提供研究基础。