护卵汤对卵巢储备功能减退大鼠血清性激素及抗苗勒管激素、抑制素B的影响※

邱冉冉 邹芝香 曾 晶 谈珍瑜

（湖南中医药大学第一附属医院妇产科，湖南 长沙 410007）

卵巢储备功能（ovarian reserve，OR）指卵巢皮质区卵泡生长、发育并形成可受精的卵母细胞的能力，此能力取决于卵巢内库存卵泡的数量和质量。随着成年女性年龄的增长，卵巢储备功能呈逐渐下降趋势，主要表现为卵泡的数量和质量下降，临床上将其称为卵巢储备功能减退（diminished ovarian reserve，DOR）。DOR是一个渐进的过程，若未引起足够的重视，可进一步导致机体内激素分泌紊乱，从而出现月经失调、闭经甚则不孕等妇科病症，并最终发展为卵巢早衰。护卵汤是全国名老中医尤昭玲教授所创，前期研究已经证实，护卵汤既可改善卵巢早衰患者的血清激素水平和主要症状［1］，又可通过多种途径改善免疫性卵巢早衰动物模型的卵巢功能及免疫功能［2-4］。本研究以环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）所致DOR动物模型为实验对象，进一步探讨护卵汤对DOR动物模型血清性激素及抗苗勒管激素的影响。

1 资料与方法

1.1 动物 健康SPF级SD大鼠60只，雌性，未孕，体质量180～220 g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK（湘）2009-0004。

1.2 主要试剂及仪器CTX（粉剂，200 mg/支，国药准字H32020857，江苏恒瑞医药股份有限公司）；雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone，P）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黄 体 生 成 素（luteinizing hormone，LH）、睾酮（testosterone，T）放免试剂盒（上海岚派生物科技有限公司）；抗苗勒激素（anti-mullerian hormone，AMH）、抑制素B（inhibin，INHB）Elisa试剂盒（武汉华美生物）。SN-695B智能放免测量仪（上海原子核研究所日环仪器一厂）；MULTISKAN MK3全自动多功能酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司），TDZ4-WS低速台式离心机（湖南湘仪仪器有限公司）。

1.3 药物 护卵汤药物组成及剂量为：菟丝子15 g，石斛10 g，生地黄10 g，熟地黄10 g，覆盆子10 g，桑椹子10 g，肉苁蓉10 g，南沙参10 g，山药10 g，莲肉10 g，莲心3 g，月季花5 g，甘草3 g，每剂总质量116 g，由湖南中医药大学第一附属医院提供。补佳乐（有效成分为戊酸雌二醇）购自拜耳医药保健有限公司，国药准字J20171038。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组60只大鼠适应性喂养7天后，行阴道脱落细胞涂片观察其性周期变化，选取动情周期为4～5 d的雌性大鼠48只纳入正式实验。然后采用随机数字表法，将其随机分为空白组、模型组、护卵汤组和补佳乐组4组，每组12只。

1.4.2 模型制备 模型组、护卵汤组和补佳乐组3组大鼠参考相关文献［5-7］，采用CTX单次腹腔注射的方法制备DOR大鼠模型，注射剂量为75 mg/kg，注射容量为1 mL（用0.9%生理盐水配制）；同时，空白组大鼠给予0.9%生理盐水1 mL单次腹腔注射。

1.4.3 给药方法 将护卵汤饮片加水浸泡0.5 h后，水煎2次，滤汁弃渣，合并药液，浓缩至含生药1.045 g/mL的药液；用生理盐水将补佳乐稀释后，制备成含药量为0.009 mg/mL的药液。

自造模第1 d开始，每天给予护卵汤组大鼠1 mL/100 g护卵汤浓缩液灌胃；每天给予补佳乐组大鼠1 mL/100 g补佳乐稀释液灌胃；空白组、模型组大鼠每天按相同剂量给予0.9%生理盐水灌胃处理。1次/d，连续4周，每周休息1 d。

1.4.4 检测指标与方法 最后一次给药24 h后，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，固定后腹主动脉采血3～5 mL，静置30 min，3000 r/min离心10 min后，取上清液。放射免疫分析法检测血清中E2、P、FSH、LH、T的含量，使用SN-695B智能放免测量仪测定；酶联免疫吸附法检测血清中AMH、INHB的含量，使用MULTISKAN MK3全自动多功能酶标仪检测，在酶标仪450 nm处读取吸光度值。具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法 所有数据均采用SPSS 20.0统计软件进行统计。计量资料用均数±标准差（x±s）表示。2组计量资料中方差齐性的组间比较采用成组t检验，方差不齐的采用秩和检验。多组计量资料两两比较，方差齐性的采用单因素方差分析，方差不齐时，用非参数秩和检验，均以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况 整个实验过程中，空白组大鼠活动、饮食及二便情况均正常，皮毛整洁，有光泽，体重渐增，动情周期规律；模型组大鼠腹腔注射CTX后活动、进食及大便次数均减少，大便偏稀，毛色枯燥且有不同程度脱毛，体重不增反降，动情周期明显延长且紊乱，镜下可见上皮细胞增多，多处于动情间期；护卵汤及补佳乐组与模型组大鼠相比，上述异常表现均较轻微。

2.2 护卵汤对DOR大鼠血清中E2、P、FSH、LH、T的影响 与空白组相比，模型组大鼠血清中E2、P的含量均降低（P＜0.01），FSH、LH、T的含量均增高（P＜0.01）；与模型组相比，护卵汤组和补佳乐组大鼠血清中E2、P的含量均增高（P＜0.05），FSH、LH、T的含量均降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清中E2、P、FSH、LH、T的比较 （x±s）

2.3 护卵汤对DOR大鼠血清中AMH、INHB的影响 与空白组相比，模型组大鼠血清中AMH、INHB的含量均降低（P＜0.01）；与模型组相比，护卵汤组和补佳乐组大鼠血清中AMH、INHB的含量均增高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清中AMH、INHB的比较 （x±s）

3 讨论

卵巢是女性重要的生殖器官，是卵子产生和排出的场所；同时又是女性一生中变化最大的内分泌腺体，其激素分泌对女性的经、带、胎、产均有重要的调节作用［8］。若卵巢储备功能减退，不仅会影响卵子的正常排出，女性无法受孕；而且会影响女性激素分泌，出现月经不调、闭经甚至全身其他系统疾病［9］。美国生殖医学会将DOR的发生发展过程分为正常阶段、隐匿型阶段、生化异常阶段、临床异常阶段等4个阶段，其中，生化异常阶段即表现为患者体内各种激素的异常升高或降低［10］。

性激素是临床上评估卵巢储备功能的常用指标，主要包括E2、P、FSH、LH、T等，可反映卵巢的生物学状况。E2由雄激素在卵巢颗粒细胞内转化合成，随月经呈周期性波动［11］。P水平与成熟卵泡数和E2水平相关，P水平升高可能反映了卵巢过度刺激的程度，也有学者认为，P/E2比可能与卵巢储备功能相关［12］。FSH及LH是由腺垂体分泌的糖蛋白激素，在卵泡发育过程中，FSH和LH的协同作用至关重要［11］。有研究发现，一侧卵巢切除后，卵巢分泌的激素下降，使垂体分泌的FSH升高，术后1～5年是DOR的高发期［13］。LH作用于卵泡膜细胞，促进卵泡膜细胞的增殖和分化，使卵泡在发育过程中有足够的雄激素维持卵泡的生长发育，同时也刺激颗粒细胞芳香化酶活性，协同增加雌激素的生成［14］。FSH升高，LH（相对）降低，或FSH/LH比值升高，预示着卵巢储备降低、卵巢低反应的发生［15］。T为雄激素之一，对于卵巢而言，其变化可能与卵巢储备功能之间密切［16-18］。本研究结果显示，单次腹腔注射CTX后可引起雌性大鼠血清中E2、P的含量下降，FSH、LH、T的含量增高，而护卵汤和补佳乐灌胃对该过程均具有良性调节作用。提示CTX对雌性大鼠卵巢储备功能具有一定的影响，而护卵汤和补佳乐对CTX所引起的DOR具有一定的保护作用。

AMH和INHB均为转化生长因子β家族成员。其中，AMH由始基卵泡及窦前卵泡的颗粒细胞分泌，能够反映始基卵泡库的大小，具有抑制始基卵泡募集，抑制卵泡生长，防止卵泡过早过快消耗的作用。因AMH由小窦卵泡分泌，且表达稳定，不受生殖周期的影响，可以早期预测卵巢功能的潜在变化［19-20］。由于AMH检测的客观性及其水平潜在的标准化，可以在月经周期任一时间检测，大多学者倾向于将AMH作为评估卵巢储备功能的金标准［21-22］。INHB主要由中、小窦状卵泡的颗粒细胞合成，可反馈抑制垂体分泌FSH，同时FSH又可以促进INHB的分泌。研究发现，卵巢储备功能下降时INHB的降低早于FSH的升高，因此，当卵巢功能减退时，血浆INHB的降低比FSH出现更早且更敏感［11，23］。本研究结果显示，单次腹腔注射CTX后可引起雌性大鼠血清中AMH、INHB的含量降低，而护卵汤和补佳乐灌胃对该过程均具有良性调节作用。这一结果与护卵汤和补佳乐对血清性激素的良性调节作用一致。

综上所述，护卵汤可通过调节实验大鼠血清中血清性激素及AMH、INHB的含量，从而对CTX所引起的卵巢储备功能减退产生保护作用。