HPV16/18 DNA在原发性胃癌患者肿瘤组织中的表达及意义

郭丹，郭建巍

1北京市海淀医院消化内科，北京100080

2解放军总医院第六医学中心检验科，北京1000480

胃癌的发生不仅与多种癌基因激活、染色体杂合缺失、抑癌基因失活等有关，还与吸烟、盐分过度摄入、长期摄入含有亚硝胺的食品及饮用水、微生物感染等有关，其中微生物感染包括幽门螺杆菌、人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）等相关病毒感染[1]。HPV是一类无包膜的双链DNA病毒，基因组长8 kb。HPV病毒常通过感染皮肤、黏膜上皮组织等，引起皮肤疣、肛门生殖器疣、喉乳头状瘤、肛门生殖器上皮内瘤等疾病[2]。已有研究表明，高危型HPV16/18的持续感染及多重感染不仅是导致宫颈癌变的主要原因，而且还与其他多种肿瘤的发生、发展密切相关[3-5]。但是，目前中国关于高危型HPV16/18感染与胃癌关系的研究尚少。因此，本研究对HPV16/18 DNA在胃癌组织中的表达情况及其与胃癌患者临床特征的关系进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年6月至2013年5月北京市海淀医院收治的行手术切除的原发性胃癌患者。纳入标准：①经病理学检查确诊为胃腺癌；②符合卫生部制定的《胃癌诊断标准（WS 316-2010）》[6]中的相关诊断标准；③术前未接受与身体耐受相关的药物化疗；④未合并其他恶性肿瘤；⑤临床资料完整。排除标准：①病例诊断标准不明确；②重复报告或资料雷同、质量较差等。根据纳入和排除标准，本研究共纳入胃癌患者72例。其中，男48例，女24例；年龄39～78岁，平均（65.20±9.27）岁；贲门癌36例，胃体癌30例，胃窦癌6例；Lauren分型[7]：弥漫型37例，肠型27例，混合型8例；临床分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期31例，Ⅲ期13例；有淋巴结转移22例，无淋巴结转移50例；有吸烟史33例；有饮酒史29例；有胃癌家族史4例。收集72例胃癌患者的胃癌组织标本。

1.2 HPV16/18 DNA检测方法及判定标准

取胃癌组织标本25 mg，在液氮中速冻后采用液氮预冷的研钵研磨组织至粉末状，随后转移至1.5 ml的离心管中。采用通用型柱式基因组提取试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司）提取基因组DNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。收集的DNA溶液于-20℃保存，用作聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）模板。采用荧光定量PCR检测收集的DNA溶液中HPV16/18 DNA，HPV16/18试剂购自中山大学达安生物技术有限公司。采用AXYGEN 8联排PCR管，依次加入反应液 40 μl，Taq 酶 3 μl，核酸模板 2 μl，振荡均匀后瞬时离心15 s。PCR反应条件为93℃2 min；93℃ 45s，55℃ 60s，10个循环；93℃ 30 s，55℃45s，40个循环；收集荧光。判定标准以核酸检测水平大于1000 copy/ml为阳性。

1.3 资料收集

收集患者的性别、年龄、体重、吸烟习惯、饮酒等基本信息，以及临床信息，如肿瘤直径、解剖部位、分化程度、分期、转移情况等。分析HPV16/18 DNA表达与胃癌患者临床特征的关系。所有患者均至少电话随访5年，统计所有患者的生存情况，并分析HPV16/18 DNA表达与患者预后的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用Logrank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV16/18 DNA表达情况

72例原发性胃癌患者中，HPV16/18 DNA阳性表达41例（56.94%），阴性表达31例（43.06%）。

2.2 HPV16/18 DNA表达与胃癌患者临床特征的关系

不同Lauren分型、TNM分期、淋巴结转移情况胃癌患者胃癌组织中HPV16/18 DNA的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其中，Lauren分型为弥漫型和肠型、TNM分期为Ⅲ期和Ⅱ期、有淋巴结转移的胃癌患者胃癌组织中HPV16/18 DNA的阳性表达率较高。而不同性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径、解剖位置胃癌患者胃癌组织中HPV16/18 DNA的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中HPV16/18 DNA阳性表达情况的比较（ n=72）

2.3 HPV16/18 DNA表达与胃癌患者预后的关系

HPV16/18 DNA阳性表达胃癌患者的5年累积生存率为58.54%，低于HPV16/18 DNA阴性表达胃癌患者的74.19%，但差异无统计学意义（χ2=1.909，P=0.167）。（图1）

图1 HPV16/18 DNA阳性表达（ n=41）和HPV16/18 DNA阴性表达（ n=31）胃癌患者的生存曲线

3 讨论

临床中，超过60%的胃癌患者确诊时已为晚期，错过了根治性切除手术的治疗时机。由于胃癌的发生、发展受多种因素调控，因此寻找可以直接影响肿瘤细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为的关键因素并加以干扰，对改善胃癌患者的治疗效果及预后意义重大。HPV是宫颈癌的主要致病因子，99%的宫颈癌患者宫颈癌组织中可以检测出HPV，尤其是高危型HPV16/18的阳性检出率更高[8-9]。此外，HPV16/18 DNA在泌尿生殖系统肿瘤、肺癌等肿瘤中的阳性表达也逐渐引起临床的广泛关注[10-11]。但目前中国关于HPV16/18 DNA对胃癌发生、发展的影响报道尚少，董卫国等[12]提出了高危型HPV16型感染可能与胃癌发生有关的观点。Ding等[13]研究显示，HPV16型感染为食管癌、胃癌发生的危险因素。Zeng等[14]进行的一项荟萃分析纳入了1917例胃癌患者，结果发现28%的胃癌患者合并HPV感染，因而认为HPV感染可增加胃癌的发生风险。Fakhraei等[15]采集了100例胃癌患者的手术标本，采用PCR扩增检测了胃癌组织中HPV DNA的表达情况，并分析HPV DNA表达与胃癌患者吸烟习惯、饮酒量、体重、胃癌家族史、解剖部位、病理诊断情况的关系，结果发现HPV DNA的阳性表达率为40%，并认为HPV感染是胃癌发生的高危因素。

为进一步明确HPV DNA与胃癌发生的关系，本研究选取经手术切除、病理确诊的原发性胃癌患者的胃癌组织标本72例，采用荧光定量PCR检测所有组织标本中HPV16/18 DNA的表达情况，结果显示HPV16/18 DNA的阳性表达率为56.94%，提示原发性胃癌患者胃癌组织中HPV16/18 DNA的阳性表达率较高，与相关报道具有一致性[12-15]，推测其原因为泌尿生殖道的HPV可能上行感染进入结肠、胃，继而引起胃部感染或病变；或HPV通过口腔，下行感染至食管，再到胃。已有研究发现，HPV感染与口腔癌、肛门癌、食管癌、结直肠癌等的发生有关，而且口腔癌和肛门癌中HPV的感染率可高达58%、80%[16-19]。还有研究从基因角度分析了HPV与胃癌的关系，结果发现HPV感染与p53基因的表达具有相关性，而作为一种肿瘤抑制基因，p53基因的突变促进了人上皮细胞的恶性转化[20]。王佐君等[21]的研究发现，在胃癌发生过程中，HPV16感染与幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的表达呈正相关，故认为HPV与幽门螺杆菌导致的恶性病变具有密切关系。由此可见，胃部HPV感染可能最初由口腔、肛门、结肠引起，并逐渐由前体病变转化为恶性病变，在此过程中，可能受到相关基因调控或幽门螺杆菌感染的影响，最终导致癌变组织中HPV16/18 DNA阳性表达，但其具体机制仍有待进一步深入分析。同时，本研究分析了HPV16/18 DNA表达与原发性胃癌患者临床特征的关系，发现不同Lauren分型、TNM分期、淋巴结转移情况胃癌患者胃癌组织中HPV16/18 DNA的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其中，Lauren分型为弥漫型和肠型、TNM分期为Ⅲ期和Ⅱ期、有淋巴结转移的胃癌患者胃癌组织中HPV16/18 DNA的阳性表达率较高。Lauren分型中，肠型胃癌以高分化、中分化腺体为主，弥散型则由散在于胃壁、无或只有少量腺体形成的肿瘤细胞构成，通常侵袭性强，易发生浆膜侵犯和淋巴结转移，因此预后更差[22]；TNM分期、淋巴结转移情况则可直接反映患者的预后，由此可见，HPV16/18 DNA表达与Lauren分型、TNM分期及淋巴结转移有关，并可能影响患者的预后。本研究结果还显示，HPV16/18 DNA阳性表达胃癌患者的5年生存率低于HPV16/18 DNA阴性表达胃癌患者，但差异无统计学意义（P＞0.05），这可能与本研究样本量少及患者病情情况有关。综上所述，HPV16/18 DNA的检测有助于评估原发性胃癌患者的病情，并指导辅助治疗，其预测预后的价值仍需扩大样本量进一步证实。