环境中抗生素抗性基因及消减途径研究

朱玥晗1,，姚 钦，李 森，郭兆奎3，王光华

(1.牡丹江师范学院 生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157012；2.中国科学院 东北地理与农业生态研究所 黑土区农业生态重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081；3.中国烟草总公司 黑龙江省公司烟草科学研究所，黑龙江 哈尔滨 150076)

0 引 言

抗生素是高等动植物以及微生物在其生长代谢过程中产生的，在低浓度下具有杀灭或抑制他种生物生长的活性物质。其杀菌作用主要通过与细胞膜相互作用，干扰蛋白质的合成，抑制生物细胞壁的合成及抑制核酸的复制和转录4种机制完成[1]。自1928年第一种抗生素—青霉素(Penicillin)被发现以来，大量的抗生素投入市场，被广泛应用于医药、卫生和禽畜养殖业。其中，用于禽畜养殖业中的抗生素，主要是作为饲料添加剂并以亚治疗剂量进入到养殖生产中，用以预防、治疗禽畜疾病和促进禽畜生长[2]。据统计，我国每年生产抗生素原料约为21万t，其中禽畜养殖业的使用量约占总抗生素产量的46.2%[3]。然而，这些抗生素在动物体内不能完全被吸收，添加在饲料中的抗生素约有60%～90%以原药或代谢物的形式，随粪尿等排泄物排出体外，污染环境；或作为有机肥施入农田土壤，将抗生素和抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)带入农田生态系统，从而引起后续的生态和食品安全问题[4]。近年来，由于抗生素的滥用而导致的大量耐药性致病菌的出现，引起了人们对抗生素及抗生素抗性基因的广泛关注[5-6]。ARGs是指微生物携带的、能够导致微生物对靶标抗生素产生抗性的遗传元件。环境中的ARGs不仅能够通过细菌增殖的方式进行垂直传播，还可以通过基因盒、质粒、噬菌体和转座子等可移动元件(Mobile genetic element，MGE)，通过水平基因转移(Horizontal gene transfer，HGT)的方式打破物种间遗传方式的传播界限，从而在不同微生物中蔓延，使更多的微生物具有抗性[7]。而一旦ARGs通过食物链转移到人类的致病细菌中，将会导致抗生素治疗失效，给人类健康带来巨大的风险。

自从2006年Pruden等[8]首次将ARGs作为新型环境污染物提出以来，国际上对ARGs在环境研究领域关注的程度日益增加。ARGs在不同环境介质中的传播、扩散，以及在环境中的持久性残留带来的潜在生态风险可能比抗生素本身对环境危害更大[9]。本文综述了ARGs在环境中的来源、传播以及消减方法和途径，旨在为了解和控制环境中ARGs的传播提供理论和技术参考。

1 环境中ARGs的种类和来源

1.1 常见ARGs的种类

ARGs在环境中的传播风险，是人类健康和生态环境所面临的安全问题之一，尤其是传播过程中诱导产生的具有抗性的致病菌，更是严重威胁到生态安全及人类健康。目前，已经发现微生物对257种抗生素具有抗性现象。国际抗生素抗性基因数据库(Antibiotic Resistance Genes Database，ARDB)包含13 293个基因、377种类型、257种抗生素、632个基因组、933个物种和124个属的耐药信息[10]。表1列举的是8大类抗生素抗性基因类群中的代表性ARGs[11]。

表1 抗生素抗性基因代表性种类Table 1 Representatives of antibiotic resistance genes

1.2 ARGs的来源

1.2.1 微生物的内在抗性。环境中ARGs的重要来源之一就是环境中微生物的内在抗性(Intrinsic resistance)[12]。从根本上说，抗生素是一类由微生物生长代谢过程中产生的具有抑制其他微生物生长繁殖的次级代谢产物。因此，内含抗性基因是合成这些抗生素的微生物本身所需具备的先决条件，用以维持其自身基本的生长代谢。即微生物的“内在抗性”就是这种微生物本身所具有的潜在的抗性；而存在于环境微生物基因组上的抗性基因的原型、准抗性基因能使微生物获得抗性[13]。

多数抗生素来源于土壤微生物，某些种类的ARGs并不是现代医疗应用导致产生的，而是在自然界中就已广泛存在。D′Costa等[14]提取到3万年前的Beringian永久冻土带沉积物，提取这些来自于晚更新世生物的DNA，通过宏基因组分析发现，这些远离人类接触的晚更新世生物的基因组上存在高多样性的抗性基因，这些抗性基因对四环素类抗生素、β-内酰胺类抗生素和糖肽类抗生素均具有抗性。2009年Allen等[15]从阿拉斯加冻土中筛选出双功能β内酰胺酶基因。2010年，Lang等[16]从相同冻土样品中筛选出新的氯霉素类抗性基因。这些结果均表明，ARGs无处不在，并同样存在于人类活动范围之外的环境中。此外，黄福义等[17]从长期未施有机肥农田土壤中检测出多种ARGs，这些基因的种类和丰度远小于施用有机肥处理的土壤。

1.2.2 外源输入。抗生素的使用导致人类与抗生素相关的细菌耐药性普遍发生。大量医源性细菌已具有较高水平的耐药性。抗生素最初被用于治疗和预防人类疾病，人类服用抗生素后，抗生素在人体内会诱导出抗性细菌，这些抗性菌株随粪便排出体外，进入到城市废水当中，流入不同的生态环境中。进入环境中的抗性细菌携带的ARGs，再经过水平转移的方式传递到各种环境土著细菌中[18]。因此，在城市污水处理厂附近均发现高丰度的ARGs，并同时检测到多重耐药菌株[19-20]。抗生素或抗性细菌随制药业废水、养殖场污水、城市生活废水及医疗废水等进入污水处理系统后，由于现有的污水处理技术对绝大部分的抗生素和抗性细菌没有明显的去除效果，一定数量的抗生素抗性细菌存留在污水中[21]，污水淤泥或沉积物经过填埋，露天堆肥后ARGs又将会被带入到土壤及周围环境中[22-23]。

同样，在禽畜养殖业中，集约化的养殖极大地促进了ARGs的蔓延。动物的肠道微生物中含有丰富的抗性细菌和ARGs。动物粪便经堆肥后直接施用在农田土壤中，增加了土壤中ARGs的丰度[24]。在水产养殖业中，粪便直接排放到水体环境中。Agersø等[25]在养殖鱼类的水体及底泥样本中，均高频地检出磺胺类及四环素类抗性基因。在地中海沿岸的养鱼场，养殖饲料虽未添加任何抗生素，但养殖场及附近的池塘中均发现四环素类tetM、tetO、tetL和tetK以及大环内酯类ermB、ermA和ermC等多种抗性基因，说明海水养殖可能促进了该渔场中抗性基因的水平转移[26]。这些水资源中的ARGs，也可通过食物链在人体中富集，如Pruden等[27]在城市饮用水及循环水中均检测到一定浓度的磺胺类和四环素类抗性基因。

2 ARGs的传播途径

ARGs在环境中的传播途径如图1所示。ARGs通过多种直接或间接的传播途径在环境介质中扩散蔓延，在传播过程中诱导出抗性菌株[28]。其中，城市污水处理厂和集约化养殖场是最为关键和主要的传播源。从图1中我们不难看出，各个ARGs储库之间相互联系，人类、动物和环境之间形成了一个循环，使得ARGs不断的进行传播和积累。

2.1 ARGs的垂直传播

ARGs垂直传播是指携带ARGs的细菌在增殖过程中将ARGs传递给子代细菌，从而提高ARGs在环境中的含量[29]。自然界中存在某些微生物，他们本身具有ARGs序列，天然地对抗生素表现出抗性性状。一部分位于基因组上的ARGs来自于那些能够产生抗生素的菌株所产生的保护机制，这些ARGs可以通过繁殖将抗性基因序列垂直地传播给下一代，从而实现抗性基因的增殖。而另一部分位于质粒上的抗性基因的垂直增殖与质粒特性有关[30-31]。这些携带有抗性基因的微生物，在环境中的适应性会受到环境中选择压力的制约，抗性基因逐代选择进化的同时，ARGs在群落中的频率会相应地升高。

图1 抗生素抗性基因传播途径Fig.1 Antibiotic resistance gene transmission pathway

2.2 ARGs的水平转移

从上世纪40年代开始，不同物种间遗传物质的传递就成为了研究热点。随着对抗生素不断地深入研究，科研工作者逐渐证实了ARGs的水平转移途径[32]。ARGs水平转移是基因组中可移动遗传因子(整合子(integron)、转座子(transposon)及质粒(plasmid)等)通过HGT机制在环境中传播ARGs。HGT机制包含基因的接合(conjugation)、转化(transformation)和转导(transduction)几种方式。HGT机制是将ARGs从一种微生物转移到另一种微生物中，从而使后者获得该抗性的一种分子机制[33]。ARGs的水平转移是微生物在抗生素药物的选择压力下长期进化的结果，是微生物适应抗生素的主要分子机制之一。

另外，宏基因组分析表明，噬菌体DNA中存在某些ARGs[34]。噬菌体在宿主中将毒力基因和ARGs整合到细菌DNA上，形成前噬菌体(Prophage)，并激活噬菌体的裂解周期，使噬菌体基因和细菌染色体分离，产生新的噬菌体，新的噬菌体持续诱导，直到宿主细胞裂解，释放出更多噬菌体到细胞外。游离的噬菌体携带ARGs，寻找新的寄主，持续进行侵染传播[35]。同时，噬菌体具有在不同种属之间转移ARGs的优势。因此，噬菌体拓宽了携带ARGs侵染的范围[36]。故此，噬菌体也是引起ARGs水平转移的方式之一。

3 不同环境中ARGs丰度变化

正确评估抗生素的生态风险、抗性机制和传播途径，需要定量分析ARGs在不同环境中的丰度。越南[37]、泰国[38]、韩国[39]、埃及[40]和印度[41]的医疗废水中，均发现了对广谱头孢霉素类抗生素和氟喹诺酮类抗生素具有抗性的大肠杆菌，并在这些具有抗性的大肠杆菌中发现了blaSHV、blaTEM、blaCTX-M、aac(6′)-Ib-cr、qnrA、qnrB、qnrS和qepA等多种抗性基因。Seifrtov等[42]采用固相萃取法，在pH为10.5的条件下，萃取富集了城市污水的喹诺酮类抗生素，喹诺酮类抗生素回收率为84%，罗红霉素回收率为89%～93%。以上研究表明，世界各地水体中均含有数目可观的ARGs，尤以磺胺类、四环素类抗性基因居多，这可能与相应抗生素的大量使用及其在环境中的残留有关[15]。

受人类活动影响，河流及沉积物中也检测到一定丰度的抗生素抗性基因。Luo等[43]对中国海河72 km长的水体和沉积物样本进行定量PCR分析，虽未检测到四环素ARGs，但在所有样品中均检测到高浓度的磺胺类抗生素sul1和sul2。其中，沉积物中sul1和sul2浓度比水体中高120～2 000倍，表明沉积物是海河流域重要的ARGs储存库[44]。随着养殖业抗生素的使用和种植业畜禽粪肥的施用，农田土壤也是ARGs一个主要来源库。Zhu等[45]采用高通量荧光定量PCR技术研究发现，施用鸡粪、猪粪和牛粪等有机肥与施用化肥和不施肥对照相比，ARGs丰度存在显著性差异。黄福义等[17]对施用猪粪的水稻土中295种ARGs进行研究发现，未施用猪粪的水稻土中仅有66种ARGs被检出，而长期施用猪粪的水稻土中有107个ARGs基因被检出，其中49种基因的丰度显著高于未施肥土壤，施用猪粪水稻土中喹诺酮类抗性基因、氯霉素类抗性基因的mexF的丰度相对于未施用猪粪水稻土增加了1 791倍。该结果表明，施用猪粪后水稻土抗生素抗性基因分布格局发生显著变化。

4 环境中ARGs的消减方法和途径

近年来，ARGs在环境中的污染情况越来越严重，科研工作者也在不断地探索如何更有效地去除环境中抗性基因及抗性细菌，以期达到更好的去除效果。

4.1 高温/低温厌氧处理

高温能够有效地去除抗生素抗性基因，一方面是因为高温有利于促进生化反应的进行[46-47]，另一方面是因为温度会改变环境中菌群的DNA组成结构[48]。

污水处理厂是抗生素抗性基因的一个重要储库，源头处理是控制抗生素蔓延的一个重要环节。Ghosh等[49]研究了嗜温(35 ℃～37 ℃)和嗜热(50 ℃～60 ℃)两相厌氧消化系统对污水中四环素类抗性基因的去除效果。研究发现，不论是嗜温还是嗜热消化过程都显著减少了tetX、tetO和intL1的丰度，其中tetX的去除率达到了85%～99%，intL1的去除率达到的80%～95%，tetA和tetO的去除率也能达到50%～80%；而在嗜温厌氧消化阶段tetA丰度出现了反弹。

Diehl等[50]采用荧光定量PCR的方法，研究了不同温度下改变好氧和厌氧条件对污泥中抗生素抗性基因的去除效果。发现在厌氧环境下，tetA、tetL、tetO、tetW、tetX和intL1这6种抗生素抗性基因的去除速率和去除效率随着温度的升高显著增加；而在好氧情况下，即使改变温度也不能明显降低四环素类抗性基因的含量。Ma等[51]通过比较嗜热和嗜温厌氧系统对抗性基因的去除效果，结果显示，ermB、ermF、tetO和tetW这4种抗性基因在嗜热厌氧系统中随着温度的升高可以有效地去除，并且效果明显优于嗜温厌氧系统。Xu[52]等在海河流域的研究发现，4℃以下磺胺甲恶唑的生物去除率为40.5%，将温度提高到25℃时，去除效率达82.9%。因此，高温厌氧处理可以更加有效地去除抗生素抗性基因。

4.2 光照

研究发现，光照可以加速ARGs的降解。Engemann等[53]采用微宇宙培养的方法，量化ARGs衰减效率及ARGs的迁移速率。在对6种抗性基因tetO、tetW、tetM、tetQ、tetB和16S rRNA进行为期14天基因水平监测发现，在阳光下6个基因的消失系数总是高于在黑暗条件下。进而，Engemann等[54]在实验室通过模拟太阳“光”和“暗”条件，通过荧光定量PCR技术，分别对tetO、tetW、tetM、tetQ和16S rRNA进行为期29天基因水平监测，发现无论氧四环素基因水平高低，光存在时基因消失率始终最高。Chen等[55]通过对可见光、模拟太阳光和紫外光等不同光辐射条件下的共轭转移，发现紫外光辐照可以极快增加共轭频率，从而使耐药菌迅速失活。研究表明，紫外光一方面可以灭活细胞，从而达到消除ARGs的垂直传播，另一方面，紫外辐射能够破坏DNA结构，降低ARGs的转换能力，从而降低抗性基因的水平转移风险[56]。紫外辐射对ARGs消除具有一定的选择作用，譬如对四环素类tetG和tetQ不能达到彻底去除的效果[57]。因此，利用紫外辐射去除抗性基因的方式还需不断完善，技术方式有待提升。

4.3 物理及化学法

随着饮用水工艺的发展，以及人类对水质量的要求逐渐提高，污水处理方法也在逐步升级更新。目前，研究较多的处理方法主要有高级氧化法、活性污泥法、生物膜处理和物理沉降法等。Öncü等[58]从大肠杆菌(E.coli)中分离出质粒DNA，比较常规氯、臭氧消毒和TiO2光催化对降低抗生素抗性的有效性研究，发现氯不影响质粒DNA结构，但TiO2光催化和臭氧均可破坏DNA超螺旋结构，并且消减程度随着氧化剂剂量的增加而增加。Cengiz等[59]将Fenton试剂和臭氧氧化法应用于去除tetM基因及其宿主大肠杆菌HB101，研究发现在合适的实验剂量下使用Fenton试剂和臭氧氧化法均可使粪便中部分抗性细菌灭活，而通过臭氧化过程以O33.125 mg·g-1粪浆的施用剂量可以使粪便中98.5%的抗性细菌灭活。Fenton试剂添加量达到50 mM H2O2和5 mM Fe2+时，可以达到最好的去除效果。除了高级氧化法之外，膜处理法对抗生素抗性基因的消减也有很好的效果[60-61]。Le等[62]比较了常规活性污泥和膜生物反应器这两种不同处理工艺对抗性基因的去除效果，发现膜生物反应器对Antibiotic resistance bacteria(ARB)、ARG和大多数靶向抗生素的清除效果更好，能够降低抗性基因的含量2.57～7.06个数量级[63]。

农田土壤中ARGs去除是一个棘手的问题，除了从源头上降低AGRs的种类和丰度外，Cui等[64]研究发现在土壤中添加生物炭也是一种改良土壤中ARGs污染的有效方法。因其成本低廉，效果显著，现已引起科学工作者的关注。段曼莉[65]通过对禽畜养殖场粪便堆放地和农用地的土壤添加生物炭，发现生物炭增加了土壤对氧四环素(土霉素)的吸附能力，加速了土壤中氧四环素的生物和非生物降解，降低了土壤、植物叶片和根系中氧四环素和ARGs的累积和转运。由此可见，生物炭可有效消减土壤中氧四环素和ARGs的含量，是一种良好的土壤修复剂。

4.4 人工湿地

人工湿地是一种常规的污水处理系统，通常作为化学、物理及生物处理之后的一种辅助处理方式，因其工艺简单，经济高效，现已被广泛应用于城镇污水处理系统[66]。Chen等[67]通过分析杭州市周边地区的污水处理厂ARGs发现，人工湿地可以有效降低2个数量级的ARGs丰度。随后，Chen[68]通过比较生物曝气滤池、紫外消毒及人工湿地这3种处理方式对ARGs的去除效果，发现人工湿地是最好的处理方式。

5 研究展望

临床医疗和畜牧养殖存在长时间、大剂量和滥用抗生素的问题，导致抗生素抗性细菌和ARGs在不同生态环境中分布、种类和丰度发生了显著变化，其潜在的环境问题和健康风险引起了有关科研工作者的关注。针对环境中的ARGs的污染所导致的生态和食品安全问题，研究制定有效的ARGs防控措施已经成为当前亟需解决的问题。目前，关于ARGs的研究已经广泛开展，但是还有很多问题尚待解决，主要包括：(1)完善地区内污染的抗性基因水平的定量解析方法；(2)研发绿色安全的饲料添加剂；(3)研发有效的污水处理技术，降低医疗废水、生活污水和养殖业废水中抗性细菌和ARGs的丰度；(4)污水处理场、畜禽粪便是ARGs的主要储存地，应在这些场所建立完整的ARGs监测预警体系，并深入开展消减环境抗生素及ARGs的相关研究，最大限度地降低ARGs流入农田、流向餐桌的风险，保障生态和食品安全；(5)结合国内外最先进抗生素消减技术，将技术落实、简化并应用到抗性基因高丰度地区，进行技术普及。