低分子肝素联合小剂量阿司匹林对原因不明复发性流产患者血栓前状态及免疫功能的影响

梁荣丽 罗 宋

广东省佛山市三水区妇幼保健院(528100)

复发性流产(RSA)80%以上发生于妊娠12周前，大部分学者认为，连续≥2次自然流产即应引起高度重视并予以充分评估[1]。发生RSA因素较为复杂，仅50%可识别其病因，多与遗传因素、免疫因素、内分泌失调、血栓前状态(PTS)、感染等有关[2]。目前，临床对RSA尚缺乏理想治疗方案，多采用阿司匹林、低分子肝素(LMWH)等治疗，但两药联用是否适用于原因不明RSA(URSA)，疗效及安全性尚缺乏充分的循证医学证据，且鲜少系统观察PTS及免疫功能相关指标的变化。本研究观察采用低分子肝素联合小剂量阿司匹林治疗URSA患者PTS及免疫功能指标变化，为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年1月—2017年1月本院就诊的URSA患者为研究对象。纳入标准：①同一性伴侣连续≥2次自然流产史；②年龄20～40岁；③无家族遗传病史，夫妻双方染色体核型检查正常；④无内分泌疾病史，生殖、内分泌激素检查未见异常(孕酮、血糖、胰岛素、甲状腺功能等)；⑤配偶精液常规检查正常；⑥无生殖道器质性病变或解剖畸形；⑦无全身及生殖道感染，TORCH病毒及支原体、衣原体检查阴性；⑧抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、抗精子抗体、抗心磷脂抗体、抗子宫内膜抗体、抗核抗体均呈阴性，无自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮等)。排除标准：①患有严重贫血、血友病、白细胞减少症等血液系统疾病者；②合并子宫腺肌症、子宫肌瘤、宫颈粘连等盆腹腔病变者；③近3个月内接受激素或抗凝药物治疗者；④对本研究用药具有禁忌证者。另选同期正常早孕妇女为正常组，无不良妊娠史，排除标准同URSA患者。本研究经医院伦理委员会审批，所有患者均签署了知情同意书。

1.2 方法

URSA患者按随机数字表法分为观察组与对照组，在确认宫内妊娠后，均予以HCG肌内注射，1000U/次，1次/d，连续应用7～14d；予以黄体酮肌内注射，20mg/次，1次/d，至妊娠10周时改为黄体酮胶丸口服，100mg/次，2次/d，至妊娠12周；叶酸片口服，0.4mg/次，1次/d，服用至妊娠12周；维生素E口服，100mg/次，3次/d，口服至妊娠20周。①对照组：予以小剂量阿司匹林口服，75mg/次，1次/d，维持用药至妊娠20周，此后根据性激素水平、PTS相关指标调整用药；②观察组：在对照组基础上，予以低分子肝素钙经脐周皮下注射，5000IU/次，每12h给药1次，使用期间每5～7d复查1次凝血功能、血小板计数(PLT)及肝肾功能，如无异常则维持治疗至妊娠12周；如出现凝血功能异常或PLT明显降低则酌情减少用量或停药，保胎失败者终止妊娠。

1.3 观察指标

1.3.1实验室检测指标患者治疗前及孕12周、20周(正常组为孕检时)，晨取空腹静脉血6ml，3ml不抗凝，3ml枸橼酸钠抗凝，离心分离血清及血浆， -80℃保存待测。抗凝血血浆采用自动凝血分析仪以免疫比浊法测定D-二聚体(DD)，采用显色底物法测定抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)活性及蛋白C(PC)活性，采用凝固法测定蛋白S(PS)活性；未抗凝血血清标本采用酶联免疫吸附法测定血清组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶原激活抑制剂-1(PAI-1)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-10(IL-10)、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)。

1.3.2随访随访至终止妊娠，统计妊娠结局：B超显示胚胎发育良好，妊娠维持至足月生产或虽早产但胎儿存活，判定为妊娠成功；治疗后B超提示胚胎停止发育或发生自然流产表示治疗失败。妊娠期并发症发生情况，包括羊水过少、妊娠期高血压疾病(PHD)、胎儿宫内生长受限(IUGR)及产后出血(PPH)等。

1.3.3安全性评价观察并记录用药期间不良反应发生情况，统计妊娠期并发症。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般临床情况

观察组51例，年龄(33.1±3.3)岁(20～39岁)，体质指数(BMI)(21.1±1.2)kg/m2(18.5～26.6kg/m2)，自然流产(3.6±0.6)次(2～6次)，孕周(8.0±1.1)周(6～10周)；对照组51例，年龄(32.1±3.2)岁(20～39岁)，BMI(21.5±1.3)kg/m2(18.0～27.0kg/m2)，流产(3.4±0.6)次(2～5次)，孕周(7.8±1.1)周(5～10周)。正常组51例，年龄(30.5±4.1)岁(20～39岁)；BMI(22.0±1.5)kg/m2(19.2～27.5kg/m2)。3组基本情况比较无差异(P>0.05)。

2.2 治疗前后PTS相关指标变化

观察组与对照组治疗前DD、t-PA、PAI-1均高于正常组，AT-Ⅲ、PC及PS均低于正常组(P<0.05)；治疗至孕12周、20周时，观察组与对照组DD、t-PA、PAI-1均显著下降，AT-Ⅲ、PC及PS均显著升高，且观察组DD、PAI-1高于对照组，AT-Ⅲ、PC、PS低于对照组(均P<0.05)，但两组t-PA比较无差异(P>0.05)。见表1。

2.3 治疗前后免疫功能相关指标变化

观察组与对照组治疗前血IL-17、IL-6、IFN-γ均高于正常组，TGF-β、IL-10、IL-4均低于NC组(P<0.05)；治疗至孕12周、20周时，观察组与对照组IL-17、IL-6、IFN-γ均显著降低，且观察组低于对照组(P<0.05)；TGF-β、IL-10、IL-4均显著升高，且观察组高于对照组(P<0.05)。见表2。

表1 各组PTS相关指标比较

a与正常组比较b与本组治疗前比较c与对照组同时间比较P<0.05

表2 各组治疗前后免疫功能相关指标比较

a与正常组比较b与本组治疗前比较c与对照组同时间比较P<0.05

2.4 妊娠结局

观察组保胎成功率高于对照组(χ2=4.857，P=0.028)。见表3。

2.5 妊娠期并发症

观察组与对照组的妊娠期并发症发生率比较未见差异(χ2=1.097，P=0.295)。见表4。

表3 两组妊娠结局比较[例(%)]

表4 两组妊娠期并发症及不良反应比较[例(%)]

2.6 药物不良反应

观察组1例胃肠道反应，1例牙龈出血，2例瘀斑，1例PLT减少，不良反应率为9.8%(5/51)；对照组2例胃肠道反应，未见其他不适，不良反应率为3.9%(2/51)。两组不良反应发生率比较无差异(P>0.05)。

3 讨论

URSA由于病因难以确定，临床早期干预和治疗难度较大，妊娠丢失率较高。目前，临床多认为URSA与封闭抗体缺乏、免疫紊乱、PTS等有关[3]。还有研究发现，约50%～65%的URSA患者存在至少一种易栓症缺陷。PTS则是易栓症的主要病理状态，可导致子宫胎盘血流动力学异常，破坏胎盘循环，导致胚胎或胎儿缺血而使其停止发育甚至妊娠丢失[4]。DD是一种交联纤维蛋白的特异性降解产物，其含量升高可激活凝血-纤溶系统。妊娠期间母体外周血DD水平存在生理性升高，当达到一定水平时可增加血栓形成倾向，增加不良妊娠结局发生风险[5]。AT-Ⅲ是一种丝氨酸蛋白酶抑制物家族成员，其抗凝作用是机体整体水平的75%，在凝血亢进状态下大量AT-Ⅲ消耗表现为外周血AT-Ⅲ水平降低[6]。PAI-1与t-PA均为机体纤溶体统中的重要调节因子，前者具有诱导血栓作用，后者具有溶解血栓作用，研究发现在URSA患者中血t-PA、PAI-1均有明显升高，而AT-Ⅲ则明显降低，且流产次数越多上述变化越明显[7]。PC和PS属于维生素K依赖性酶原，PC活化后对凝血因子Ⅶa及Ⅴa具有灭活作用，从而抑制血液凝固；PS则可消除凝血因子Ⅹa对Ⅴa、Ⅸa对Ⅶa的保护作用而促进Ⅶa的水解[8]。本研究中，URSA患者在孕早期干预前DD、t-PA、PAI-1均明显高于正常组，而AT-Ⅲ、PC及PS活性显著低于正常组。证实URSA患者存在PTS，且可能存在抗凝蛋白“联合缺陷”，即同时存在≥1种易栓症。及早预防性抗凝治疗对提高URSA患者的保胎成功率可能具有积极意义。

阿司匹林能够抑制血小板的聚集、活化，抑制血栓形成，改善胎盘血流状态[9]。LMWH对选择性抗凝血因子Xa/抗凝血酶Ⅱa(抗Xa/抗Ⅱa)比为2:1～4:1，高于传统肝素的1:1，故具有更强的抗凝作用及更少的出血等不良反应。同时不易结合血小板及其因子4(PF4)，故较少引起PLT减少[10]。文献报道显示，LMWH单用或与小剂量阿司匹林联用可使12%～96%的URSA患者获得正常妊娠[11-12]。本研究中，观察组采用LMWH与小剂量阿司匹林联合治疗，88.2%患者保胎成功，较单用阿司匹林的对照组明显提高成功率，而妊娠期并发症及不良反应方面并未见明显差异。两组治疗后外周血DD、t-PA、PAI-1均较治疗前明显降低，且观察组低于对照组，而AT-Ⅲ、PC及PS活性显著升高且观察组高于对照组。提示LMWH与小剂量阿司匹林联合治疗URSA安全有效，可通过调节PTS而提高患者活产率。

妊娠期母胎免疫耐受被打破可导致流产[13]。已有研究显示，Th1/Th2、Th17/Treg平衡偏移参与了URSA的发生及发展过程。如Th1型细胞分泌的细胞因子IFN-γ水平升高，而由Th2型细胞分泌的细胞因子IL-4水平降低，导致母婴免疫耐受被打破[14]。IFN-γ可抑制滋养层细胞生长以及胚胎正常发育，从而导致妊娠丢失；IL-4、IL-10等则可诱导B细胞增殖、分化，抑制Th1细胞因子的生成，从而产生免疫耐受作用，有利于维持妊娠及胎儿生长发育[15]。Th17细胞则主要通过分泌IL-17发挥其免疫促炎作用，IL-6高表达及TGF-β低表达共同诱导Th17细胞的分化、成熟及促炎因子的释放。Treg细胞则可通过免疫抑制作用而维持母胎免疫耐受平衡，进而维持良好的妊娠结局。IL-10及TGF-β可介导Treg细胞免疫抑制，进而抑制IL-17的表达[16]。仇笑笑等[17]报道显示，正常早孕孕妇的外周血Th17细胞因子呈低表达，而Treg细胞因子呈高表达，即Th17/Treg平衡偏向Treg细胞，这对母胎免疫耐受及妊娠维持具有重要意义，但在URSA患者中则呈相反变化。本研究亦显示，URSA患者在孕早期外周血IL-17、IL-6、IFN-γ水平较正常组明显升高，而IL-10、TGF-β及IL-4水平则明显降低，证实URSA患者可能存在母胎免疫耐受受损。经相应干预治疗至孕12周、20周末，两组的IL-17、IL-6、IFN-γ、TGF-β、IL-10、IL-4水平均明显改善，且观察组各项指标的改善幅度均优于对照组，在孕12周时观察组各项指标改善基本趋于平稳。表明URSA孕妇存在明显的免疫失衡，应用LMWH联合小剂量阿司匹林较单用阿司匹林能够更快速、有效地纠正这种失衡，可能也是减少URSA患者妊娠丢失的主要原因之一。

综上所述，LMWH联合小剂量阿司匹林治疗URSA可减少妊娠丢失率，提高活产率，且不增加不良反应及妊娠期并发症，其机制可能与减轻PTS及调节免疫失衡有关。但本研究样本较少，且缺乏多点监测结果，还有待进一步完善研究内容。