复合缓释酸制剂对猪流行性腹泻病毒的体外作用研究

赵勤辉

（意大利亚士可化工大药厂，上海 200233）

1 猪流行性腹泻流行病学与概况

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的，以严重的肠炎、腹泻、呕吐、脱水和仔猪高死亡率为显著特征的猪急性高度接触性肠道传染病，PEDV主要侵害哺乳仔猪，7日龄以内的仔猪死亡率可高达100%。

该病于1971年首次在英国被发现，1978年比利时Pensaert MB教授分离出病原，命名为CV777毒株，我国1978年从上海分离到沪毒株。2010年在我国大面积暴发PED，造成了数以千万计哺乳仔猪的死亡，2013年又重创了美国养猪业，超过17个州的养殖场感染了PEDV，造成大量仔猪的死亡。

2 PEDV基因组结构

PEDV为单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科，只有一个血清型，对外界环境有较强的抵抗力。PEDV基因组至少有7个开放阅读框，基因组长度30 000 kb左右，编码纤突蛋白（spike protein, S），小包膜蛋白(envelope, E)，糖膜蛋白（membrane, M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid， N）等4种主要结构蛋白和3种非结构蛋白（复制酶蛋白1a和1b、ORF3蛋白），其中S蛋白位于病毒粒子外表面，在病毒侵入宿主细胞和诱导中和抗体产生的过程中发挥重要作用[1]，利用其表面的S蛋白与猪肠道细胞表面受体结合，通过膜融合侵入细胞内，集中在猪小肠绒毛上皮细胞中复制，新生病毒通过粪便和呕吐物排出体外。PEDV的主要中和抗原位于S基因的1 495-1 914 bp处[2]。

3 PEDV的传播方式与特点

PEDV在37℃条件下最适合的pH是6.5～7.5。据美国明尼苏达大学兽医学院Dee等研究报道，PEDV在豆粕粉中可以存活180 d[3]。PEDV可以通过饲料传播并造成母猪和生长猪发病[4]。PED主要靠粪口传播，与发病猪、带毒猪直接接触或者接触被污染的食物、水、车、人以及环境、灰尘、气溶胶也能传播PEDV。PEDV具有组织嗜性的特点，主要侵害肠绒毛上皮细胞，引起变性、萎缩、脱落。

4 PED的防控难点

1)新变异株不断出现，不同毒株之间的交叉保护率低。

2)病毒分离困难，有经验的实验室分离成功率都只能做到20%～30%。

3)疫苗免疫效果评估困难。目前单纯的实验室评价血清或者初乳中SIgA并不能与发病率建立起很好的挂钩。在实际生产中经常看到，有些猪场没打疫苗也不发生PED，也有许多猪场打了疫苗还发生PED；有的猪场去年打了疫苗但发病死亡率高，第二年不打疫苗发病死亡率却不高。老板、管理者、兽医莫衷一是。

4)疫苗免疫效果尚待商榷。PEDV主要以肠道局部免疫为主，传统的活苗抗原滴度有限，致弱后的疫苗毒株在肠道的稳定性和增殖能力降低，难于侵入肠道，产生的保护力有限；灭活苗不能产生有效的黏膜免疫，保护率偏低。

5)混合感染居多（PEDV与TGEV、PoRV、PRRSV、PCV2、PRV），增加了防控难度。

6)返饲是传统的防控PED的方法，但是存在2个问题，一是返饲前要做特定病原体的检测，存在一定的难于预见的散毒风险；二是返饲始终是属于被动的防控，即出了问题之后才去返饲，属于亡羊补牢型防控。

7)当然行业内也摸索出了一定的防控PED的方式方法，如多点式饲养，后备猪进群前PEDV活毒驯化，通过实验室监测后备猪过了排毒期才能进种群，活苗与死苗相结合的接种方法，私制自家苗等，但是总体效果还是不尽如人意。

所以，PED的防控目前还是行业内的难题之一。决定PED发病与否的主要是以下几个因素：毒量、毒力、肠道菌群与SIgA。所以，降低猪群中的病毒载量，提升猪群肠道健康度以及初乳管理是防控PED的经典法则。

5 酸制剂降低PEDV载量的相关研究

美国明尼苏达大学的Trudeau等人研究表明，有机酸不仅在防控肠道致病细菌上有效果，对PEDV等病毒也具有很好的抑制作用，不同商品化酸制剂添加在饲料中对PEDV具有不同的抑制作用（表1）[5]。

6 复合缓释酸对PEDV的体外影响研究

6.1 实验材料

Vero细胞，复合缓释酸，AH2012病毒液，反转录酶，ddH20，探针定量试剂，PEDV抗原检测试剂盒，DMEM，24孔板，96孔板，胰酶，PBS，恒温箱等。

6.2 实验步骤略

6.2.1 实验一：复合缓释酸对PEDV核酸的作用

1）复合缓释酸对PEDV核酸的作用（37 ℃作用30 min）

结果：从组内趋势看，作用30 min后，随着复合缓释酸的稀释，病毒含量逐渐增高，1:1 000稀释后的复合缓释酸对病毒核酸作用不明显，病毒含量明显高于其他4组，等体积1:1混合组的PEDV含量最低，表明高浓度复合缓释酸可以破坏病毒的核酸，从图1可看到1:1～1:100稀释复合缓释酸都能够显著的破坏病毒核酸。

2）复合缓释酸对PEDV核酸的作用（37℃作用2 h）

37℃条件下，复合缓释酸病毒与复合缓释酸1:1混合和复合缓释酸稀释1:10的梯度都对病毒的核酸有明显破坏作用，阴阳性成立，结果成立，表明37℃作用2 h对病毒都有破坏作用。

从图2可看出，阴阳性成立，复合缓释酸和病毒1:1混合作用后，有明显的破坏病毒核酸的作用。

6.2.2 实验二：复合缓释酸对病毒蛋白的作用（37℃，室温作用2 h）

图1 复合缓释酸对PEDV核酸的作用（37 ℃作用30 min）

图2 复合缓释酸对PEDV核酸的作用（37 ℃作用2 h）

表1 不同商品化酸制剂对饲料中PEDV的抑制作用

表2 试验结果

表3 未过滤与过滤复合缓释酸不同稀释比例的细胞毒性作用

图3 复合缓释酸对病毒蛋白的作用（37 ℃，室温作用2 h）

结果：37 ℃作用2 h后，病毒本身蛋白有所降解，浓度降低，与复合缓释酸混合后，同样发现1:1和1:10混合对病毒蛋白有明显的破坏作用（见图3）。表明，一定浓度的复合缓释酸作用一定时间对PEDV病毒蛋白具有破坏作用。

6.2.3 实验三：复合缓释酸细胞毒性实验

结果：从表3的实验结果可以看出，未过滤的复合缓释酸稀释度为1:4导致细胞发生病变，对细胞有毒性作用；过滤后的复合缓释酸稀释度在1:2对细胞有毒性，推测过滤后的复合缓释酸可能有损失。表明，小于等于1:8的稀释比例对Vero细胞都不会产生毒性细胞病变。

6.2.4 实验四：复合缓释酸对PEDV致病性作用（TCID50）

结果：1)可看到复合缓释酸原液与病毒等比例稀释，不论作用多久，病毒完全不产生病变，对病毒致病性有完全杀灭作用；

2)复合缓释酸稀释 1：2，1：4，1：8且在作用15 min，30 min对病毒有轻微的灭毒作用，作用1 h 则可起到大部分杀灭作用（见表4），说明作用时间长短对杀灭总用是有影响的，但总体来说，复合缓释酸对病毒有较好的杀灭作用。

实验表明，一定浓度的复合缓释酸作用PEDV一段时间后，会使PEDV失去感染细胞和产生细胞病变的能力。

图4 复合缓释酸对PEDV复制的影响

表4 复合缓释酸不同稀释比例对病毒产生细胞病变能力的影响

6.2.5 实验5：复合缓释酸对PEDV复制的影响（病毒拷贝数）

结果：现象观察发现1：4组无病变，1：8有轻微病变，1：16局部出现病变，1：32，1:64，128和病毒对照都全部病变，没有太大差异（见图4）。病毒拷贝数定量结果显示，复合缓释酸1:16稀释后仍然能够显著抑制病毒的复制，具有较好的抗病毒效果。

实验5表明，一定浓度的复合缓释酸作用PEDV一段时间后，可以抑制病毒的复制。

综上所有实验得出结论，一定浓度复合缓释酸对病毒的核酸、蛋白都有破坏作用，可以直接杀灭病毒。同时，一定浓度复合缓释酸可以抑制病毒的细胞中的增殖，影响病毒的复制。